HOXD13与先天性马蹄内翻足的相关研究及其作用机制探讨

论文摘要

前言先天性马蹄内翻足（idiopathic congenital clubfoot,CCF）是常见的严重危害儿童健康的先天畸形之一,发病率在1～4.5‰。遗传因素在CCF的发病过程中发挥重要作用,遗传度为65%。但其遗传方式、外显率等均不清楚,易感基因尚未确定。目前研究较多的与CCF发病相关的基因主要集中在与足踝部的骨骼、软骨、肌肉和神经发育相关的基因,如COL9A1,CASP10,WNT7A,HOXD13等。我室前期应用ETDT方法对84个CCF核心家系HOXD基因簇内的4个多态位点进行分析,提示HOXD13基因可能是先天性马蹄内翻足的易感基因。HOX基因家族是一个高度保守的转录因子家族,该家族在胚胎发育阶段基本体轴和次级体轴的形成中起作用,所有的HOX蛋白都是通过一个60个氨基酸的DNA结合基序来结合特定的DNA序列而发挥其转录调控作用。Hoxd13参与的遗传通路,特别是受其影响的下游靶基因目前还不清楚。有研究表明,Hoxd13可以激活小鼠成纤维细胞中Slim1基因的表达,提示Hoxd13可能调控Slim1的表达。本实验进一步探讨HOXD13,SLIM1与先天性马蹄内翻足的关系以及Hoxd13在大鼠胚胎肢体发育中调控Slim1的机制。方法标本:84例CCF患者外周静脉血和15例CCF患者肌肉组织标本由中国医科大学附属第二临床医院小儿外科提供,3例同年龄组的正常人足部肌肉组织由中国医科大学法医学院提供。所有标本使用均经患者知情并同意。成年SD大鼠购自中国医科大学实验动物中心,所有的实验过程都遵照动物保护条例。1、变性梯度凝胶电泳技术检测HOXD13基因编码区的突变PCR扩增84例患者HOXD13基因全部2个外显子,应用20%～80%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛查2个外显子的突变情况。2、半定量RT-PCR,免疫组织化学和Western-blot方法研究HOXD13和SLIM1基因在CCF患者肌肉组织中的表达分别提取CCF患者及正常人肌肉组织的RNA和蛋白质,应用半定量RT-PCR和Western-blot检测HOXD13和SLIM1基因的表达;分别制备CCF患者及正常人肌肉组织的常规石蜡包埋切片,应用免疫组织化学方法检测HOXD13和SLIM1基因的表达。3、Western-blot和免疫荧光检测孕12.5天的大鼠胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1的表达应用Western-blot技术检测孕12.5天的大鼠胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1的表达,应用免疫荧光检测12.5天的大鼠胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1基因表达的组织定位。4、在大鼠L6GNR4细胞系中外源表达HOXD13后观察Slim1基因表达构建HOXD13的真核细胞表达载体pcDNA-HOXD13,转染大鼠L6GNR4细胞后观察Slim1基因表达水平的改变。5、应用P-MATCH软件预测了大鼠Slim1基因5’上游序列转录因子的结合位点获取Slim1基因5’上游1500bp序列信息（http://www.ensembl.org）,应用P-MATCH软件预测其转录因子结合位点。6、荧光素酶报告基因系统PCR扩增Slim1基因启动子序列,构建荧光素酶报告载体pGL3-Slim1。pGL3-Slim1和pcDNA-HOXD13转染大鼠L6GNR4细胞,观察HOXD13对Slim1的转录调控作用。7、凝胶阻滞实验孕12.5天胎鼠下肢肢芽组织核蛋白和3’生物素标记的探针（含有位点2）在凝胶阻滞缓冲液中室温结合1小时,10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜、紫外交联后,应用化学发光检测系统检测结果。8、染色质免疫沉淀实验提取L6GNR4细胞和孕12.5天胎鼠下肢肢芽和脑组织的染色质,甲醛交联、酶切后应用Hoxd13抗体进行沉淀,沉淀下来的染色质通过PCR扩增检测结果。结果1、在84例CCF患者外周静脉血中未发现HOXD13基因的编码区突变。2、CCF患者肌肉组织中存在HOXD13（5/15,33.3%）和SLIM1（7/15,46.7%）基因的表达下调。3、在孕12.5天的胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1共表达在趾间组织。4、外源表达HOXD13可明显激活大鼠成肌细胞L6GNR4中Slim1基因的表达。5、在大鼠Slim1基因启动子区域存在2个Hoxd13的可能结合位点,分别命名为Hoxd13结合位点1（-1164～-1158）和Hoxd13结合位点2（-1140～-1134）。6、Hoxd13通过和Hoxd13结合位点2结合发挥转录调控作用。L6GNR4细胞瞬时转染了pGL3-Slim1（-1185）荧光素酶报告基因表达载体和HOXD13表达载体后,HOXD13可以明显提高荧光素酶活性。我们又构建了缺失型的pGL3-Slim1（-1154）荧光素酶报告基因的表达载体,转染后的荧光素酶活性与转染pGL3-Slim1（-1185）比较,HOXD13同样可以明显提高荧光素酶活性。我们改变了Hoxd13结合位点2的核心序列,构建了pGL3-Slim1（-1154m）表达载体,转染L6GNR4细胞后发现当Hoxd13结合位点2突变后HOXD13对荧光素酶活性无影响。综合以上结果,说明Hoxd13结合位点2可能是HOXD13的结合位置。7、在体外Hoxd13蛋白可以和Slim1基因启动子区位点2直接结合。EMSA结果表明当Hoxd13蛋白质存在时出现阻滞的DNA-蛋白质复合体,当加入Hoxd13抗体时出现超阻滞条带。证明在体外Hoxd13和预测的Hoxd13结合位点2可以直接结合。8、在孕12.5天大鼠胚胎肢体发育过程中Hoxd13可以和Slim1基因启动子区Hoxd13结合位点2直接结合。我们应用染色质免疫沉淀技术验证在体内Hoxd13和Slim1基因上游序列的结合作用。沉淀的L6GNR4细胞染色质中有Hoxd13结合位点2的扩增,无对照位点的扩增。为进一步验证在胚胎肢体发育过程中Hoxd13是否和Slim1启动子结合,我们以孕12.5天的大鼠下肢肢芽组织为研究对象进行了染色质免疫沉淀实验,沉淀的肢芽染色质有Hoxd13结合位点2的扩增,无对照位点的扩增,而在对照脑组织中没有Hoxd13结合位点2的扩增。实验结果表明在大鼠胚胎肢体发育过程中Hoxd13蛋白可以和Slim1启动子区的Hoxd13结合位点2结合发挥其转录调节作用。结论1、HOXD13基因的编码区突变可能不是CCF发病的原因。2、HOXD13基因和SLIM1基因的表达下调可能与CCF畸形的发生有关。3、在大鼠胚胎肢体发育过程中Hoxd13直接结合Hoxd13结合位点2调控Slim1基因的表达。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一、HOXD13,SLIM1与先天性马蹄内翻足的相关研究
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文二、先天性马蹄内翻足中HOXD13调控SLIM1基因表达机制研究
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介