论文摘要
Sox9是与哺乳动物性别分化形成有关的重要基因之一。本文在脑、精巢和卵巢分离和克隆到了两个黄颡鱼Sox9基因，其中从精巢和脑中分离到的序列一致，通过序列比对分析，称Sox9a1；从卵巢中分离到的称Sox9a2。黄颡鱼Sox9a1 cDNA 1604 bp[不包括poly（A）]，包括5′非翻译区70 bp，3′非翻译区142 bp，阅读框1392 bp，编码464个氨基酸，计算的蛋白分子量为50.62 kDa，其中99-176个氨基酸为保守的sox-TCF HMG-box，305-351个氨基酸为富含P／Q的结构域，352-464个氨基酸为TA结构域（transcription activation domain）。黄颡鱼Sox9a2全长cDNA 1843 bp[不包括poly（A）]，包括5′非翻译区313 bp，3′非翻译区159 bp，阅读框1371 bp，编码457个氨基酸，计算的蛋白分子量为50.24 kDa。其中111-188个氨基酸为保守的sox-TCF HMG-box，321-358个氨基酸为富含P／Q结构域，359-457个氨基酸为TA结构域。黄颡鱼Sox9a1和Sox9a2核苷酸序列的相似性为64％，但阅读框序列的相似性为71％。黄颡鱼Sox9a1和Sox9a2的氨基酸的相似性为65％，黄颡鱼Sox9a1和其他动物Sox9的相似性平均为73％，其中只有与斑马鱼Sox9a相似性较低为61％；而黄颡鱼Sox9a2与这些动物Sox9的相似性平均为67％，由此可见，黄颡鱼Sox9a1和其他动物的相似性要高于Sox9a2和其他动物的相似性。由系统树可见Sox9明显可分成三支，一支包括两栖类、爬行类、鸟类和人Sox9；另外两支为鱼类Sox9，其中鲤鱼Sox9b、黄颡鱼Sox9a2和斑马鱼Sox9b三个为一支；另一支包括虹鳟、黄鳝、鲻鱼、鲀鱼的两个Sox9以及黄颡鱼Sox9a1和斑马鱼Sox9a，该支又明显地把同一鱼类中分离到的两个Sox9分成两个小支，如黄鳝Sox9a1和黄鳝Sox9a2，而斑马鱼的Sox9a和黄颡鱼的Sox9a1分别属于这两个分支。RT-PCR结果显示Sox9a1在雌雄黄颡鱼前脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和性腺均能检测到其表达，而在肌肉没检测到其表达；Sox9a2只在卵巢检测到，在其他组织均没检测到。说明Sox9a1和Sox9a2的表达存在着组织表达特异性，它们的调控也肯定存在着一定的差异。本文分离了黄颡鱼Ftz-F1同源基因，包括Ad4BP／SF-1和LRH-1。在精巢分离和克隆的黄颡鱼Ad4BP／SF-1 cDNA，Ad4BP／SF-1全长cDNA 1986 bp[不包括poly（A）]，包括5′非翻译区79 bp，3′非翻译区461 bp，阅读框1446 bp，编码482个氨基酸，计算的蛋白分子量为53.9 kDa。其中22-88个氨基酸为DBD结构域，89-116个氨基酸为Ftz-F1结构域。在肝脏分离到的黄颡鱼LRH-1，LRH-1全长cDNA 1945 bp[不包括poly（A）]，包括5′非翻译区207 bp，3′非翻译区238 bp，阅读框1500 bp，编码500个氨基酸，计算的蛋白分子量为57.19 kDa。其中39-105个氨基酸为保守的DBD结构域，106-132个氨基酸为Ftz-F1结构域。另外，还分离到一个没有活性的不含锌指结构和没有AF-2结构域的黄颡鱼LRH-1′，其全长1663 bp，5′非翻译区283 bp，3′非翻译区330 bp，阅读框1050 bp，编码350个氨基酸，计算的蛋白分子量为39.7 kDa。黄颡鱼LRH-1和Ad4BP／SF-1的氨基酸相似性只有59％。黄颡鱼LRH-1和其他动物的LRH-1相似性为79％-85％，和其他动物的SF-1相似性为59％-66％；黄颡鱼Ad4BP／SF-1和其他动物的SF-1为57％-96％，其中和人SF-1只有57％，其相似性低于黄颡鱼LRH-1和人SF-1的相似性60％。Ftz-F1系统树显示可分成两大分支，其中，鱼类SF-1单独聚为一大支，另外一支又分成人等脊椎动物SF-1和LRH-1，提示鱼类SF-1和LRH-1很早就分化了，但人类SF-1和LRH-1则分化稍晚。RT-PCR结果显示黄颡鱼LRH-1除了在肌肉、心脏没检测到外，在脑、肝、脾、肾和性腺中均有表达；本实验使用RT-PCR法在所取组织均没检测到Ad4BP／SF-1的表达，其原因可能是在成鱼组织中表达量比较少，但也有可能是引物不合适。P-450芳香化酶（P450arom）是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本文首次分离和克隆了黄颡鱼卵巢和脑P450芳香化酶基因P450arom A和P450aromB。黄颡鱼P450arom A cDNA全长1914bp[不包括poly（A）]，5′端非翻译区13 bp，3′端362 bp，阅读框（Open reading frame，ORF）1539 bp，翻译成513个氨基酸，计算的蛋白质分子量为58.7kDa。P450aromB cDNA全长2260 bp[不包括poly（A）]，5′端非翻译区有205bp，3′端555 bp，阅读框（open reading frame，ORF）1500 bp，编码500个氨基酸，计算的蛋白质分子量为56 kDa。黄颡鱼P450aroma和P450aromB cDNA序列相似性为49％，但两者阅读框的相似性为62％。黄颡鱼P450aromA和P450aromB的相似性只有60％；黄颡鱼P450aroma的氨基酸序列与鱼类卵型的同源性比较高，除了黄鳝60％外，其他均在70％以上，和脑型的则比较低为60％左右；相反，脑型P450aromB则和其他鱼类脑型的相似性较高达70％以上，和卵巢型的相似性也只有60％左右；它们与鸡和人P450arom的相似性稍低均为50％左右。从相似性比较可见黄颡鱼P450aromB和P450aromA均与鲶鱼的相似性最高，体现了两者亲缘关系较近。脑型和性腺型芳香化酶基因在芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区、芳香化酶特异保守区Ⅱ和血红素结合区Ⅲ的相似性很高，以人芳香化酶序列为基准，Ⅰ区性腺型的相似性为70％-73％，脑型的为66％-70％；Ⅱ区则高达73％-86％和78％-82％；Ⅲ区则在73％左右。系统发育分析表明P450arom可分为两支，一支包括软骨鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类，另外一支为除了软骨鱼类外的其他鱼类，并且该支又明显地分为性腺型和脑型P450arom，黄颡鱼P450aromA与鱼类性腺型P450arom属于同一支，而P450aromB与鱼类脑P450arom同一分支，至于这两支芳香化酶是否与在鱼类进化的长河中早期出现的基因组复制有关，还没有直接证据，但现在普遍接受这一解释。荧光实时定量RT-PCR研究结果显示，P450aromA在性腺发育为Ⅱ期鱼的前脑、下丘脑、脑垂体、精巢、肝脏中没检测到其表达，只在卵巢中表达，这说明P450arom A的表达具有组织特异性，并由此可推测其对卵巢发育起着重要作用；而P450aromB在前脑、下丘脑、垂体、卵巢、精巢均有表达，但肝脏没检测到其表达，脑部表达量高于性腺，但性腺发育处于Ⅱ期的雌雄鱼脑部P450aromB的表达总量没显著差异，卵巢中P450aromA的表达量是P450aromB的18.7倍。使用荧光定量RT-PCR法测定了性腺发育处于不同阶段的鱼脑、肝、肾和性腺中Sox9a1、Sox9a2、LRH-1、P450aromB和P450aromA的表达。结果，Sox9a1在雌、雄鱼（性腺Ⅳ、Ⅴ期）的肝、脑以及精巢表达量相对较高，在肾和卵巢表达量明显低，其中，雌雄鱼之间脑、肝和肾的表达水平没显著差异，卵巢和精巢之间有显著差异。以雌鱼脑表达量为1，则肝的表达量平均为雌鱼脑的2倍左右，而肾脏的表达量只有30％左右。Sox9a1在精巢的表达量和性腺发育有关，Ⅳ、Ⅴ期精巢中的表达两大约为雌鱼脑的50％左右，但Ⅱ期精巢的表达量是其4倍左右。Sox9a1在发育早期的精巢和卵巢的表达没显著差异。Sox9a2在卵巢各阶段的表达呈现在Ⅲ和Ⅳ期出现高峰，Ⅳ期和Ⅵ期表达量相对较低。LRH-1在各组织表达量测定揭示该基因在卵巢、雌雄鱼的肝以及脑表达量比较高，在肾的表达量比较低。在不同发育阶段卵巢的表达显示在Ⅲ期和Ⅴ期卵巢表达量明显比其他各期高，和Sox9a2有相似的表达模式。P450aromB在雌鱼脑的表达量较雄鱼脑要高，但差异不显著。在卵巢不同发育期，该基因呈现出在Ⅱ期晚表达量开始上升，在Ⅳ期出现高峰，到Ⅴ期、Ⅵ期表达量则下降，从趋势上Ⅲ期的表达量应该比Ⅱ期晚高，但结果并非如此，有待继续验证。黄颡鱼P450aromB在卵巢不同发育期的表达模式和在金鱼和虹鳟的研究结果基本一致。P450aromA的表达量在Ⅱ期晚期、Ⅲ期表达量明显高于Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期，Ⅱ期早期和其他各期均没显著性差异，以Ⅱ期早期该基因的表达量为1，则Ⅱ晚期和Ⅲ期分别是其6倍和5倍左右，而Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期值有其表达量的10％以下。从Sox9a2、LRH-1和P450aromA的表达模式可见，Sox9a2和LRH-1具有类似的表达模式，说明了他们之间存在着调控关系，这和在哺乳类等的研究结果一致，在Ftz-F1的启动子区存在结合Sox9蛋白的序列。但芳香化酶基因的表达和Sox9、LRH-1没明显的相关性，和现有在芳香化酶基因启动子区域存在Sox9和Ftz-F1结合位点存在着不一致，很可能虽然有结合位点，但并不起主要调节作用，但需要进一步实验证实。
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相关论文文献
- [1].三疣梭子蟹ftz-f1基因的克隆及相关核受体基因在蜕皮中的功能分析[J]. 海洋与湖沼 2015(06)
- [2].鱼类性别相关基因FTZ-F1的研究进展[J]. 水产学杂志 2010(04)
- [3].细菌表达dsRNA介导的家蚕FTZ-F1基因的RNA干扰[J]. 昆虫学报 2011(05)