论文摘要
研究目的：通过肺癌细胞系体外基质胶（matrigel）三维培养来探索肺癌细胞能否形成毛细管样结构（capillary-like structures,CLS）,观察体外肺癌细胞形成血管生成拟态（vasculogenic mimicy,VM）的能力及不同细胞系成管能力的差异。并观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在NCI-H446（小细胞肺癌细胞系）中的表达及抗VEGF单抗其成管能力的影响。利用caspase广谱抑制剂（Z-VAD-FMK）,以慢病毒颗粒为载体,干扰细胞凋亡调控通路中的核心因子—caspase-3在NCI-H446中的表达,从而观察肺癌细胞系体外成管能力的变化情况,来讨论细胞凋亡与VM形成之间的关连,初步探讨VM及抗凋亡作为新的肺癌治疗靶点的临床意义。内容：首先,对NCI-H446和H1299（肺腺癌）两个肺癌细胞系进行普通二维培养,待细胞传至4-7代且处于对数生长期时对细胞进行三维培养,观察两组细胞能否成管及成管能力的差异。后选择成管能力较强的细胞系以抗VEGF单抗Z-VAD-FMK的干预,观察实验组与对照组之间成管的变化情况。并进一步在基因水平上对caspase-3进行沉默,建立稳定转染细胞系,进行三维培养,观察实验组和对照组成管的变化情况。研究方法：1.对NCI-H446和H1299细胞进行体外基质胶三维培养。2.抗VEGF单抗对NCI-H446进行免疫细胞染色,并干预其三维培养设立对照组和实验组,观察不同组间成管差异。3.应用ZVAD-FMK对NCI-H446细胞干预并设立对照组和实验组,进行基质胶三维培养来观察不同组间成管差异。并用流式细胞技术检测加入ZVAD-FMK前后细胞凋亡率的差异。4.在基因水平上对caspase-3进行沉默,建立稳定转染细胞系,进行三维培养,观察实验组和对照组成管的变化情况。并利用RT-PCR及western-blot技术检测转染效果。结果：1.对NCI-H446和H1299进行三维培养显示：两种细胞系都可以形成CLS,说明肺癌细胞具有形成VM的能力。且NCI-H446细胞较H1299细胞具有更强的成管能力。2. NCI-H446可以表达VEGF蛋白；抗VEGF单抗在NCI-H446三维培养早期加入可以干扰CLS形成；而在NCI-H446成管后加入则CLS只在一定程度上到受到影响（有少许管状及网格样结构被破坏）,但总体影响不大。3.应用ZVAD-FMK对NCI-H446进行三维培养显示：ZVAD-FMK在NCI-H446培养早期加入可以干扰CLS形成；而在后期加入则显示已形成的CLS并未受到影响。4.在基因水平上对caspase-3进行沉默,建立稳定转染细胞系,进行三维培养显示：三维培养连续24h发现转染组细胞成管能力较对照组明显下降,三维培养过程中并未形成任何管状或网络样结构,细胞散在分布；而对照组则见明显CLS形成。结论：1.肺癌细胞系可形成CLS,说明肺癌细胞有形成VM的潜在能力。且恶性程度高的肺癌细胞系（NCI-H446）成管能力强于恶性程度较低的肺癌细胞系（H1299）。2. NCI-H446可以表达VEGF蛋白,目VEGF对于VM的形成具有一定的促进意义,抗VEGF单抗可在一定程度上干扰CLS的形成。3.凋亡对于VM的形成具有一定的促进意义,凋亡抑制剂在早期加入可以阻止VM的形成,晚期则不起作用。4.对于VM阳性患者,临床靶向治疗应同时考虑血管内皮细胞（Endothelial Cell,EC）和肿瘤细胞。而如果凋亡被证明为肺癌VM形成的始动因子,那么拮抗凋亡的药物将有望成为像表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）抑制剂的靶向药物。
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标签：血管生成拟态论文; 凋亡论文; 靶向治疗论文; 三维培养论文; 血管内皮生长因子论文;