论文摘要
乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染严重威胁着人类的健康,全球有超过3.5亿慢性感染患者,每年约50万死于HBV相关性疾病。HBV是非细胞毒性嗜肝DNA病毒,它自身并不引起肝细胞损害,所造成的肝脏炎症严重程度与肝内持续的HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）有关。因此研究HBV慢性感染中HBV特异性T淋巴细胞的特性,将为我们设计治疗性乙肝疫苗提供新的思路。活化的CTL通过两条途径清除病毒:即胞溶途径——分泌穿孔素、颗粒酶等细胞毒分子直接杀伤病毒感染的靶细胞或者Fas/FasL途径介导靶细胞凋亡和非胞溶途径——分泌细胞因子抑制病毒复制。急性HBV感染的患者体内两种途径都存在,外周血能检测到较强的HBV表面抗原、核心抗原和多聚酶抗原特异性的CTL,绝大多数急性自限性感染患者都可以通过获得性免疫和天然免疫的协调作用清除病毒而痊愈,并且获得免疫力——保护抗体和HBV特异性记忆T淋巴细胞。虽然慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性细胞免疫反应很弱,但是在肝脏浸润淋巴细胞中仍然可以分离和扩增到HBV特异性T淋巴细胞克隆,从低病毒滴度,HBeAg阴性的患者外周血也能检测到少量HBV特异性CD8+T淋巴细胞,因此慢性乙型肝炎患者并不完全缺乏HBV特异性T淋巴细胞,却不能有效的清除病毒。研究表明HBV特异性T淋巴细胞存在功能障碍,分析它们功能障碍的原因,可能为我们治疗HBV提供一定的线索。HBV慢性感染导致CTL功能障碍的机制还没有完全阐明,可能包括特异性细胞剔除（耗竭、阴性选择）或者细胞功能耐受（无能、免疫忽视）。婴幼儿时期的垂直传染可能导致HBV特异性T细胞克隆清除,而成年人感染初期大剂量病毒抗原则容易导致细胞耗竭,致使慢性感染患者体内病毒特异性T细胞数量减少。机体对病毒特异T细胞功能的抑制也是多方面的:HBV慢性感染患者CD4+CD25+Treg细胞的增加抑制了CD8+T淋巴细胞的功能;CD4+T细胞的缺乏或者Th2免疫偏离导致HBV特异性CD8+T淋巴细胞的成熟障碍;DC抗原递呈功能受损和DC1/DC2的失衡诱导T细胞的耐受等等。CTL的功能与其分化发育的阶段也是密切相关的。尽管对于记忆细胞是否来源于效应细胞的分化模式还存在分歧,但是急性感染免疫应答的三个阶段是很明确的。CD8+T淋巴细胞大量活化的效应阶段,效应细胞的凋亡阶段,以及记忆细胞的形成阶段。并且病毒清除后建立保护性免疫,记忆T淋巴细胞在不依赖抗原的方式下保持稳态增殖,再次遭遇抗原能够迅速活化。在此过程中,细胞表面分子表达的形式和数量也随之发生变化,根据不同的细胞表面分子,可以界定CD8+记忆T细胞的不同功能亚群。如随着T细胞的分化和成熟,CD8+T细胞表达不同的共刺激分子（CD27、CD28、CD45RA）,根据它们的变化CD8+T淋巴细胞分为初始T细胞（CD27+CD28+CD45RA+）,记忆T细胞（CD27+CD28+CD45RA-）和效应T细胞（CD27-CD28-CD45RA+）。CD27-CD28-CD45RA+/-和CD27lowCD28-CD45RA+/-表型的CD8+T淋巴细胞有杀伤靶细胞的能力。CD8+T细胞功能的发挥和表型的分化成熟都伴随着淋巴细胞不断地迁移,因此不同时期趋化因子受体的表达也不相同。根据趋化因子受体CCR7的表达可以将细胞分为CCR7-的效应记忆细胞和CCR7+的中心记忆细胞,结合CD45RA还可以进一步将CD8+T细胞分为CD45RA+CCR7-（初始T细胞）,CD45RA-CCR7+（中心记忆T细胞）,CD45RA-CCR7-（效应记忆T细胞）和CD45RA+CCR7-（终末分化效应细胞）。然而慢性病毒感染可能改变记忆T细胞的分化状态,或者阻碍T细胞的分化进程,从而影响T细胞的效应功能。慢性感染会改变病毒抗原的免疫优势性,急性感染中的亚优势表位诱导的免疫应答,在慢性感染中可能占据主导。抗原长期持续的存在可能影响到记忆T细胞的分布,急性感染中记忆细胞获得归巢受体后会回归淋巴组织,而慢性感染中大量的病毒抗原特异性T淋巴细胞聚积在炎症局部,不但影响了记忆细胞的形成,而且导致T细胞功能耗竭。LCMV慢性感染的研究中就发现,随着感染的慢性化进程,LCMV特异性T淋巴细胞逐渐失去分泌细胞因子能力、增殖能力和细胞毒效应功能,最终功能完全耗竭。基于共刺激分子CD27和CD28的研究发现各种病毒感染初期,特异性CD8+T细胞的分化表型变化不大,均为早期初始型,但是随着感染慢性化,不同的病毒诱导T细胞分化停滞在不同阶段,EB病毒和丙型肝炎病毒（HCV）特异性CD8+T细胞多为早期初始T细胞（CD27+CD28+）,而巨细胞病毒（CMV）感染则富集晚期CD8+T细胞（CD27-CD28-）,人类免疫缺陷病毒（HIV）特异性CD8+T细胞多为中期亚群（CD27+CD28-）。HIV、HCV特异性CD8细胞都因为分化发育障碍,严重影响了它们的功能。那么慢性乙型肝炎患者外周血和肝脏内HBV特异性T淋巴细胞是否也存在分化障碍呢?最近大量的研究表明,PD-1/PD-L1信号途径可能参与了慢性病毒感染中CTL的耗竭,阻断这个信号通路可以恢复耗竭CD8细胞的功能。高表达抑制受体PD-1可能是CD8细胞耗竭的标志。从HBeAg阴性的病毒载量低的慢性感染患者外周血中分离得到的HBV特异性T细胞体外Peptide刺激可以恢复其产生IFN-γ、细胞毒性及增殖反应的功能。经过拉米夫定治疗的患者体内也发现HBV特异性CD8细胞频率有所增加,并且Cr51杀伤实验检测到它们的细胞毒性功能也增强。这些证据都表明慢性乙型肝炎患者体内的HBV特异性CD8细胞的功能并没有完全丧失,是可以逆转的。那么PD-1/PD-L1信号途径是否也参与了HBV慢性感染导致病毒特异性T淋巴细胞功能低下的过程呢?PD-1分子是CD28免疫受体家族成员,广泛表达在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞,以及CD4-CD8-T细胞表面,其N端含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）,C端含有免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）。PD-1的表达和结构都提示它具有免疫调节功能。PD-1最初的发现是作为负向调节信号参与维持自身抗原和肿瘤的耐受。PD-1缺陷小鼠自发产生自身免疫疾病是PD-1参与免疫负向调节最直接的证据,而且SLE、RA和I型糖尿病等自身免疫性疾病患者也检测到PD-1位点的单核苷酸多态性。PD-1在其他疾病中（如肿瘤、寄生虫感染等）也发挥着负向免疫调节作用最近小鼠LCMV病毒慢性感染的研究中发现功能耗竭的LCMV特异性CD8+T细胞上调表达PD-1分子,PD-1/PD-L1信号途径控制着CD8细胞的耗竭和抗病毒功能。阻断慢性持续病毒感染的小鼠体内PD-1途径不但可以恢复耗竭CD8细胞的功能（增殖能力、分泌细胞因子和细胞毒功能）,而且促进小鼠更加有效的控制病毒。HIV病毒特异CD8+T细胞上也高表达PD-1,阻断后同样恢复细胞的功能。这个发现为慢性病毒感染的治疗提供了新的希望。已经有线索提示PD-1/PD-L1信号途径可能在肝脏炎症免疫应答中发挥重要的作用。①PD-L1基因敲除小鼠,抗原活化后的特异性CD8+T细胞在肝脏大量聚积,并且对ConA诱导的自身免疫性肝炎非常敏感。②PD-1缺陷小鼠感染腺病毒时,在肝脏有大量抗原特异T细胞活化,迅速清除病毒。③病毒感染和外源性干扰素都可以上调肝细胞上PD-L1的表达,阻断PD/PD-L1信号途径可以阻断肝细胞的凋亡。④最近HCV慢性感染研究发现HCV特异性CD8细胞的耗竭伴随着PD-1的上调,并且持续表达。而HCV急性感染PD-1的上调表达是移过性的,当细胞获得记忆表型或者重新恢复功能后,PD-1表达下降。阻断PD-1/PD-L1后病毒特异性CD8+T细胞增殖能力增加。到目前为止,HBV免疫应答的大多数工作都是研究外周血,但有证据表明慢性乙型肝炎患者肝脏内聚集了大量的HBV特异性CTL,因此研究慢性乙型肝炎患者肝脏内HBV特异性CTL的特性可能更为重要。我们利用MHC I-肽五聚体（Pentamer）技术直接离体检测慢性乙型肝炎患者外周血和肝脏内浸润淋巴细胞中HBV表位肽特异性CTL,结合流式和胞内细胞因子染色技术分析和比较慢性乙型肝炎患者外周血和肝脏内HBV特异性T淋巴细胞的活化、分化、成熟表型和功能,并初步探讨了PD-1分子与肝脏内HBV抗原特异性CTL功能低下的关系。我们的实验发现:（1）大多数慢性乙型肝炎患者肝脏局部都存在HBV特异性CTL;（2）肝内HBV特异性细胞表型多为CD45RA-CCR7-CD27+CD28+/-;（3）胞内细胞毒分子缺乏,增殖和分泌IFN-γ能力受损;（4）肝脏浸润的HBV特异性CTL表面高表达PD-1分子。实验结果提示慢性乙型肝炎患者肝脏局部聚集了大量HBV特异性T淋巴细胞,它们大都分化成熟障碍,功能低下,PD-1分子可能参与了HBV特异性CTL耗竭的过程。
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