中国野葡萄醛脱氢酶基因遗传转化拟南芥的研究

论文摘要

对中国野葡萄醛脱氢酶（ALDH）基因进行了遗传转化拟南芥的研究。取得的主要成果如下:1.以课题组前期研究获得的重组质粒pGEM-T-ALDH为模板,通过PCR扩增ALDH基因片段,将其与pENTR/D-Topo载体连接后获得入门克隆载体pENTR/D-ALDH,将pENTR/D-ALDH与质粒pHellsgate8进行LR反应后获得葡萄ALDH基因的植物干扰表达载体pHellsgate8-ALDH。2.将质粒pWR306中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA 1300,构建了中间过量表达载体pWR-Ⅱ;将重组质粒pGEM-T-ALDH的ALDH基因片段定向克隆到中间过量表达载体pWR-Ⅱ,构建了葡萄ALDH基因的植物过量表达载pWR-Ⅱ-ALDH。3.以农杆菌介导的花序浸沾法转化拟南芥,分别获得了卡那霉素抗性株系20株和潮霉素抗性株系9株。PCR检测证明卡那霉素抗性株系中7个为阳性株系,潮霉素抗性株系中3个为阳性株系。4.对经PCR检测呈阳性的过量表达载体转基因拟南芥进行Real-Time PCR检测,结果表明在转基因植株中,ALDH的相对表达量远高于野生型。转基因突变体植株和野生植株在形态上有一定的差异,说明葡萄ALDH基因在拟南芥中表达对其生长发育有一定影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 RNA干扰技术研究进展
• 1.1.1 RNAi的定义
• 1.1.2 RNAi的发现
• 1.1.3 RNAi的作用机制
• 1.1.4 RNAi的应用
• 1.2 葡萄遗传转化方法研究进展
• 1.2.1 农杆菌介导法
• 1.2.2 DNA直接转化法
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.3 农杆菌介导的花序浸蘸法
• 1.3.1 农杆菌介导的花序浸蘸法转化机理
• 1.3.2 农杆菌介导的花序浸蘸法转化应用进展
• 1.4 转基因植株检测方法的研究
• 1.4.1 标记基因的利用
• 1.4.2 DNA水平的检测
• 1.4.3 RNA水平的检测
• 1.4.4 蛋白质水平的检测
• 1.5 醛脱氢酶基因的研究进展
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 供试品种
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 醛脱氢酶基因植物干扰表达载体的构建
• 2.2.2 醛脱氢酶基因植物过量表达载体的构建
• 2.2.3 转化农杆菌
• 2.2.4 转化拟南芥及抗生素筛选
• 2.2.5 转基因拟南芥的DNA提取及PCR检测
• 2.2.6 过量表达载体转基因拟南芥的RNA提取及Real-Time PCR检测
• 2.2.7 过量表达载体转基因拟南芥表型分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 葡萄醛脱氢酶基因植物干扰表达载体PHELLSGATE8-ALDH的构建
• 3.2 葡萄醛脱氢酶基因植物过量表达载体PWR-Ⅱ-ALDH的构建
• 3.3 根癌农杆菌的转化及鉴定
• 3.4 转基因拟南芥的PCR检测
• 3.5 过量表达载体转基因拟南芥的REAL-TIME PCR检测
• 3.6 过量表达载体转基因拟南芥表型分析
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介