重组改构人肿瘤坏死因子协同顺铂对小鼠Lewis肺癌抑制作用及机理的研究

论文摘要

目的:肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,尽管临床上规范化治疗的实施,但肺癌患者的5年生存率仍不足20%,如何增强现有的抗肿瘤药物的抗瘤作用,提高化疗疗效,是目前发展抗肿瘤药物应用的研究方向之一。本研究拟通过Lewis肺癌动物实验模型,采用生理盐水、顺铂（cisplatin,DDP）、重组改构人肿瘤坏死因子（recombinant mutant human tumor necrosis factor,rmhTNF）及两药联合进行干预,测量各组动物的平均瘤重,计算抑瘤率,测定肿瘤细胞凋亡率和细胞周期以及Lewis肺癌组织内凋亡抑制因子（Survivin）及增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平,从而阐明重组改构人肿瘤坏死因子联合顺铂对肺癌有协同抑制作用,并初步探讨其可能发生作用的机制。方法:1、建立模型和实验分组:将40只体重为19-21克健康雄性C57BL/6小鼠称重,随机分为4组（每组10只）:生理盐水组（对照组）、DDP组（6.15mg/kg）、rmhTNF组（150万U/kg）以及rmhTNF（150万U/kg）与DDP（6.15mg/kg）联合组。将小鼠Lewis肺癌（LLC）细胞株接种于各组小鼠右上肢腋窝皮下,构建Lewis肺癌动物实验模型。2、抑瘤作用评价:接种后隔日检查皮下肿瘤生长情况。接种第7天,都可扪及肿瘤,待第12天,扪及皮下肿瘤平均大小约（1.0×1.0×1.0）cm3时开始按分组分别给予瘤内注射生理盐水、DDP、rmhTNF、rmhTNF +DDP,每只0.2mL,连续三天,停药24小时后脱颈椎处死全部小鼠,立即剥离皮下肿瘤,称取瘤重,计算各组平均瘤重及抑瘤率。3、流式细胞术测定Lewis肺癌移植瘤细胞凋亡率及细胞周期。4、免疫组化学法检测Lewis肺癌移植瘤组织内Survivin、PCNA表达水平,比较各组之间的差异。5、采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Survivin的表达,比较各组之间的差异。6、统计分析:用SPSS13.0统计学软件进行数据处理,各组数据以均数±标准差（x±s）的形式表示。两个独立样本组间均数比较用t检验,多组间均数差异性比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差异有极显著性,P>0.05为差异无显著性结果:1、平均瘤重及抑瘤率: DDP组和rmhTNF组小鼠的平均瘤重分别为2.964±0.091g、3.010±0.089g较对照组的瘤重3.576±0.126g减轻（P<0.05）,但两单药组之间无明显差异（P>0.05）。rmhTNF+DDP组小鼠的平均瘤重为2.267±0.050g与对照组相比减轻尤为明显（P<0.01）。而rmhTNF+ DDP组的平均瘤重低于DDP组和rmhTNF组,差异有统计学意义（P<0.05）。从抑瘤率来看,与对照组相比,DDP组、rmhTNF组及rmhTNF+DDP组对小鼠移植瘤均有明显的抑制作用,DDP组、rmhTNF组及rmhTNF+DDP组的抑瘤率分别为17.115%、15.828%,36.605%。其中以联合用药组的抑瘤率最为显著。联合用药的q值等于1.2,表明两药具有协同作用,rmhTNF具有增强DDP抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长的作用。2、流式细胞术检测结果:与对照组相比,DDP组和rmhTNF组细胞G0/G1期比例增加,S期比例下降,增殖指数PI下降（P<0.05）;rmhTNF+DDP组测得细胞G0/G1期比例明显增加、S期比例明显下降,增殖指数PI明显下降（Ρ<0.01）。而且rmhTNF+DDP组与DDP组和rmhTNF组相比G0/G1期比例增加、S期比例下降,增殖指数PI下降（Ρ<0.05）。瘤组织经流式细胞术检测凋亡率结果显示:DDP组、rmhTNF组和rmhTNF+DDP组均测得典型的亚二倍体凋亡峰,rmhTNF组、DDP组的凋亡率分别为:20.269%、21.599%,与对照组16.103%比较凋亡率逐渐升高,差异有统计学意义（P<0.05）。但两单药组之间无明显差异（P>0.05）。rmhTNF+DDP组肿瘤组织中癌细胞的凋亡率为28.175%较对照组升高更为明显,有显著性差异（P<0.01）,而rmhTNF+DDP组凋亡率高于DDP组和rmhTNF组,差异有统计学意义（Ρ<0.05）。3、免疫组化检测结果:免疫组化结果显示:rmhTNF组和DDP组肿瘤组织中PCNA阳性标记指数（Labeling index,LI）平均值分别为（40.875±3.271）%、（40.500±4.567）%均低于对照组（61.375±6.759）%,差异有统计学意义（P<0.05）。但两单药组之间无明显差异（P>0.05）。rmhTNF+DDP组肿瘤组织中PCNA LI为（29.125±3.833）%与对照组相比降低尤为明显（P<0.01）。而rmhTNF+DDP组的PCNA LI低于DDP组和rmhTNF组,有显著的统计学意义（P<0.05）。rmhTNF组和DDP组肿瘤组织中Survivin LI平均值分别为（31.000±2.507）%、（30.375±2.875）%低于对照组（43.750±4.166）%,差异有统计学意义（P<0.05）,但两单药组之间无明显差异（P>0.05）。rmhTNF+DDP组肿瘤组织中Survivin LI为（22.375±4.138）%与对照组相比有显著的统计学意义（P<0.01）。而rmhTNF+DDP组的Survivin LI低于DDP组和rmhTNF组（P<0.05）。4、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Survivin的表达结果:rmhTNF组和DDP组的Survivin mRNA相对表达水平较对照组下降（P<0.05）。但两单药组之间无明显差异（P>0.05）。rmhTNF+DDP组的小鼠肿瘤组织中Survivin mRNA表达明显下调,较对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）,而rmhTNF+DDP组的Survivin mRNA表达与rmhTNF组和DDP组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、本研究选用与人类肺癌极为相似的理想动物模型,对肺癌的进一步研究有着重要意义。2、重组改构人肿瘤坏死因子与顺铂联合应用,具有协同抗肿瘤的作用,可明显抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,改变细胞周期的分布,使肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。3、DDP组、rmhTNF组及rmhTNF+DDP组均可下调小鼠Lewis肺癌移植瘤Survivin和PCNA蛋白表达水平,但rmhTNF+DDP组对Survivin和PCNA蛋白表达的影响更为显著。4、rmhTNF+DDP组对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长有明显抑制作用,并显著下调小鼠Lewis肺癌移植瘤的Survivin和PCNA蛋白表达水平。据此可推测,其发生的可能机制是:一是联合组可通过抑制PCNA蛋白的表达,减低DNA聚合酶的活性,干扰肿瘤细胞DNA的合成,从而抑制肿瘤细胞的增殖。一是联合组通过抑制凋亡抑制蛋白Survivin基因的表达水平,使Caspase介导的凋亡信号传导途径激活,达到促凋亡的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 重组改构人肿瘤坏死因子协同顺铂对小鼠Lewis 肺癌抑制作用及机理的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 Survivin 及PPAR-γ在肺癌组织中作用的研究进展
• 致谢
• 个人简历