论文题目: 金属β-内酰胺酶（IMP-1）表达、纯化、鉴定及与抑制剂DansylCnSH、EDTA相互作用机制和功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 检验诊断学
作者: 丁世家
导师: 邱宗荫
关键词: 金属内酰胺酶,突变体
文献来源: 重庆医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:建立pET9a/d-IMP-1在E·coli BL21中表达,纯化方法,并得到高纯度的金属β-内酰胺酶(IMP-1);研究IMP-1与抑制剂EDTA相互作用机理并测定其动力学参数;合成新的巯基抑制剂DansylCnSH,探讨其与IMP-1相互作用机理和荧光性质的改变,以及用DansylC2SH作荧光探针检测IMP-1;构建IMP-1的突变体并在E coli JM109中表达,纯化,研究IMP-1突变体与底物相互作用动力学参数,并探讨其功能。 方法:将pET9a/d-IMP-1质粒转化到E·coli BL21细菌中,大量表达后,超声裂解,裂解液经SP-Sepharose Column和SP-G75 Column纯化,所得产物用SDS-PAGE鉴定,并用MALDI-TOF-MS测定其分子量和纯度;用头孢噻啶Cephaloridine作底物,研究不同pH值和温度下,EDTA使IMP-1去活性过程,酶催化反应速度并用Arrhenius方程式计算活化能Ea和熵变△S;化学合成新的巯基抑制剂DansylCnSH,探讨该抑制剂与金属β-内酰胺酶相互作用时荧光性质的改变并测定其解离常数K_D,荧光强度FI与IMP-1浓度关系曲线,用头孢哨噻吩Nitrocefin作底物,测定用DansylCnSH作抑制剂时IMP-1和IMP-1W28A与底物相互作用的水解曲线,并由酶催化反应速度,计算抑制常数K_i,同时用DansylC2SH作荧光探计测定细胞培养液和粗提物中IMP-1浓度;设计IMP-1点突变引物,以pKF18/d-IMP-1质粒DNA为模板进行LA-PCR,产物经纯化后测定其序列并转化到E-coli JM109中表达,并经色谱柱纯化后得到突变体V25A,V25I,V25G,测定不同突变体与底物相互作用动力学参数和CD图,研究pH值对不同突变体酶催化反应的反应速度的影响。 结果:金属α-内酰胺酶(IMP-1)在E·coli BL21中经表达后其
论文目录:
符号说明
前言
中文摘要
英文摘要
正文 金属β-内酰胺酶(IMP-1)表达、纯化、鉴定及与抑制剂DansyI CnSH、EDTA相互作用机制和功能分析
第一部分 金属β-内酰胺酶(IMP-1)的表达，纯化和鉴定
第二部分 金属β-内酰胺酶(IMP-1)与EDTA相互作用机理探讨
第三部分 金属β-内酰胺酶(IMP-1)与DansyI CnSH相互作用研究
第四部分 金属β-内酰胺酶(IMP-1)突变体的构建及功能分析
综述 金属β—内酰胺酶的研究进展
全文总结
致谢
攻读博士学位期间发表论文
发布时间: 2005-07-22
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