论文摘要
目的：泪腺功能异常是干眼的主要原因,而自身免疫泪腺炎如Sjogren’s综合症是泪液分泌不足的常见原因。本研究的目的是探讨兔泪腺上皮细胞激活自体外周血淋巴细胞,诱导兔自身免疫干眼模型,并对临床体征和组织病理变化进行评估;采用四环素基因表达调控系统（Tet系统）调控的AAV载体介导IL-10转基因治疗,观察IL-10在泪腺和眼表的表达时间及变化,评估IL-10对泪腺免疫病理和眼表体征的作用。方法：1.结合滤膜分离和密度梯度离心法分离提纯兔泪腺上皮细胞（pLGEC）,对分离细胞的活性、纯度、形态特征进行鉴定。分离的pLGEC体外培养2d后gamma射线照射,与等量（105细胞/孔,96孔板）自体外周血淋巴细胞（PBL）混合培养5d. [3H]-thymidine掺入法鉴定PBL增殖率。对培养前及培养后PBL行细胞表面抗T细胞、B细胞、CD4和CD8单克隆抗体染色和FACS分析。2.新西兰白兔左眼下泪腺切除,分离泪腺上皮细胞体外培养2d,gamma线照射,与体外独立培养2d的自体PBL混合培养5d,[3H]-thymidine掺入法测定PBL激活情况。自平行培养的混合细胞内分离激活的PBL,用于自体过继转移动物模型制备。[3H]-thymidine掺入实验测定激活指数大于2者将分离的PBL经耳静脉注射回供体兔诱发自身免疫干眼病（ID/IV）.致病组一组注射后4周处死（ID/IV4, n=9）,另一组注射后8周处死（ID/IV8, n=6）.阴性对照组（n=8）摘除左眼下泪腺,耳静脉注射未经混合培养的自体外周血淋巴细胞（未激活）。未经任何处理的正常兔作为正常对照组（n=4）。注射前及注射后每2周双眼眼表临床检查,包括SchirmerⅠ实验、BUT和rose Bengal染色。处死后收集兔上、下泪腺,结膜和唾液腺进行组织病理H&E染色和免疫组化染色。3.与泪腺上皮细胞混合培养激活的自体外周血淋巴细胞注射回供体兔诱发自身免疫性泪腺炎（n=16）。注射后4周,一组下泪腺注射AAV2-tetON-vIL-10（1x 108pfu/200 L）转基因治疗（ID/Rx, n=8）;未注射组作为对照组（ID,n=8）,两组兔每日饮用水内均加入强力霉素（200mg/kg）,诱导vIL-10表达。致病后16周（转基因治疗后12周）处死兔取泪腺进行病理和免疫组化分析。结果：1.光学显微镜镜检显示分离的细胞主要为直径为16 um的单个腺泡细胞或3-20个细胞组成的细胞团,培养4天时细胞聚集成腺泡样细胞团。PBL-pLGEC混合细胞培养组[3H]一thymidine掺入增殖指数是单独PBL组或照射后pLGEC组的5-8倍；FACS分析显示与未激活的单独培养的外周血淋巴细胞群相比,被自体泪腺上皮细胞激活后的外周血淋巴细胞内T细胞数含量增加了约2倍。在激活前外周血CD4+T细胞占T细胞的20%,而激活后增高到70%。CD8+T细胞在激活反应前及激活反应后含量无明显改变。B细胞的含量在激活前后也保持不变或减少。2.与正常组相比,静脉注射致病后4周泪液分泌减少50%,泪膜破裂时间缩短70%。Rose Bengal染色显示眼表上皮缺损,但与直接泪腺注射致病组比较程度减轻。静脉注射后4周泪腺内腺管周围和小血管周围频繁可见以CD+T细胞为主的大的淋巴细胞浸润灶；同时可见淋巴流动样浸润区。注射后8周泪腺病理改变较4周加重,颚下腺腺叶内也可见大面积的腺泡变性区和淋巴流动样浸润灶。3.ID,/Rx组临床体征较ID组总体明显改善。组织病理检查显示ID组可见散在大的淋巴细胞浸润灶和腺泡变性或萎缩,而ID/Rx组淋巴浸润灶减少、变小。与ID组相比,ID/Rx组泪腺内CD18+细胞增加5倍之多,CD4：CD8比率减少16倍,而RTLA.细胞数两组间无差异。结论：1.结合滤膜分离和密度梯度离心法可获得较高纯度的泪腺上皮细胞,培养、照射后可成功激活自体外周血淋巴细胞。2.被泪腺抗原激活的淋巴细胞经耳静脉注射回供体兔可归巢到泪腺和颚下腺并促发自身免疫过程,说明这些部位本质上包含抗原提呈细胞,这些细胞表达致病性自身抗原表位；同时还含有招募CD4-T细胞的化学因子和淋巴细胞归巢分子。这种经耳静脉途径制备的兔干眼模型,由于颚下腺和泪腺同时受累,更逼真的模拟了Sjogren’s综合征。该模型更适用于阐明Sjogren’s发病机理和病理生理的研究,同时也是评估治疗方法的理想实验模型。3.AAV介导的vIL-10转基因治疗可改善实验性自身免疫泪腺炎的临床体征和病理变化。通过免疫组织化学分析发现vIL-10治疗不仅仅是通过免疫抑制机制,而更可能是通过提高CD8-调节性T细胞促进受体细胞介导的免疫调解反应的产生。