玉米弯孢霉叶斑病菌突变株致病相关性状分析与基因克隆

论文摘要

玉米弯孢霉叶斑病是由新月弯孢霉（ Curvularia lunata （Wakker）Boed）引起的一种重要玉米病害。尽管近年来由于抗性品种推广,病害得到一定控制,但由于该病原菌存在明显生理分化现象,且我国玉米种质资源遗传基础狭窄,抗性资源趋同化严重,该病害再次爆发的风险性较大。目前关于该菌致病分子机理研究报道少且不深入,这直接影响了对该病害有针对性的综合防治。为此本研究通过ATMT（Agrobacterium-mediated transformation）方法构建玉米弯孢霉叶斑病菌突变株,分析突变株致病性相关生物学性状,克隆致病相关基因。1、通过农杆菌介导的基因转化技术（ATMT）,以野生强致病型菌株CX3为出发菌,构建玉米弯孢霉叶斑病菌转化子。首先研究了弯孢霉叶斑病菌分生孢子萌发时间、农杆菌菌株、共培养时间与温度对转化效率的影响,从而优化了转化条件,使转化效率提升至84±5个/106个分生孢子,共获得ATMT突变株1,454个。2、从大量突变株中筛选到9个在菌落形态颜色、生长速度等性状上有显著变化的突变株,分别测定其产孢量、细胞壁降解酶活性、毒素、致病相关基因表达量等指标,并通过离体和活体接种确定突变株致病性,获得弱致病性突变株5个,为研究致病相关基因提供了良好材料。3、通过PCR、Southern blot确定突变株CLM-1648为T-DNA单拷贝插入。利用Genome Walking、RT-PCR技术,并结合生物信息学,克隆了T-DNA插入位点的基因。经过BLAST分析,该基因与小麦黄斑叶枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis ）ATP-phosphoribosyl transferase基因序列有78%的相似性。该基因全长1,175 bp,含有两个内含子,cDNA全长1,038 bp,在弯孢霉叶斑病菌基因组中为单拷贝。RT-PCR分析表明T-DNA插入影响了该基因在菌体内的表达量。推测该基因通过调控组氨酸代谢或其它致病相关生理过程影响病菌的致病性。4、对突变株CLM-1648的生物学性状观察显示,该突变株菌落颜色浅、产孢量增加、分生孢子萌发速度快,但与野生型菌株CX3相比,对洋葱表皮侵染能力和对感病玉米植株的致病性明显下降,其病情指数下降70%左右。突变株在基本培养基（MM）很难形成或仅能形成极少量分生孢子,说明该突变株无性繁殖能力、营养利用能力和对营养的选择性均发生明显变化,推测这些变化与致病性减弱有关。所克隆基因的功能需通过基因敲除进行验证。已经以质粒pV2为基础构建了针对该基因进行敲除的基因同源重组载体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语索引
• 第一章 文献综述
• 1.1 玉米弯孢霉叶斑病发生与危害
• 1.2 病害爆发原因与潜在威胁
• 1.3 玉米弯孢霉叶斑病菌致病机理
• 1.3.1 细胞壁降解酶
• 1.3.2 黑色素
• 1.3.3 毒素
• 1.4 其他玉米叶斑病菌的研究进展
• 1.4.1 生理生化水平
• 1.4.2 基因水平研究
• 1.5 植物病原菌致病基因克隆的几种主要方法[56,57]
• 1.5.1 同源克隆
• 1.5.2 突变体方法
• 1.5.3 基于表达序列标签（ EST） 的基因克隆
• 1.5.4 mRNA 差别显示
• 1.6 展望
• 1.7 本论文研究意义及内容
• 参考文献
• 第二章 玉米弯孢霉叶斑病菌突变株构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌株和质粒
• 2.1.2 主要培养基配制
• 2.1.3 主要试剂配制
• 2.1.4 萌发分生孢子的制备
• 2.1.5 载体的准备
• 2.1.6 转化
• 2.1.7 转化体系的优化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 质粒pBHt1 的转化
• 2.2.2 ATMT 转化
• 2.2.3 孢子萌发时间对转化率的影响
• 2.2.4 农杆菌菌株对转化率的影响
• 2.2.5 共培养条件对转化率的影响
• 2.2.6 转化子插入位点验证
• 2.3 结论与讨论
• 参考文献
• 第三章 突变株筛选与致病性相关性状测定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 供试寄主
• 3.1.3 主要培养基配制
• 3.1.4 主要试剂配制
• 3.1.5 初步筛选
• 3.1.6 菌落形态及生长速度测定
• 3.1.7 产孢量测定
• 3.1.8 细胞壁降解酶活性测定
• 3.1.9 色素和毒素的变化
• 3.1.10 致病性测定
• 3.1.11 致病相关基因表达分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 突变株库初步筛选
• 3.2.2 菌落形态及生长速度
• 3.2.3 产孢量
• 3.2.4 细胞壁降解酶活性
• 3.2.5 代谢产物的变化
• 3.2.6 致病性测定
• 3.2.7 突变株致病相关基因表达
• 3.3 结论与讨论
• 参考文献
• 第四章 突变株CLM-1648 基因克隆及生物学性状观察
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试菌株和质粒
• 4.1.2 供试寄主
• 4.1.3 主要培养基配制
• 4.1.4 主要试剂配制
• 4.1.5 CLM-1648 生物学性状观察
• 4.1.6 致病性测定
• 4.1.7 T-DNA 插入突变验证
• 4.1.8 Southern Blot
• 4.1.9 Genome Walking
• 4.1.10 基因拷贝数分析
• 4.1.11 基因表达量分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 CLM-1648 生物学性状
• 4.2.2 T-DNA 插入的PCR 检测结果
• 4.2.3 T-DNA 插入拷贝数
• 4.2.4 T-DNA 插入位点序列克隆
• 4.2.5 T-DNA 区域插入两端序列的分析
• 4.2.6 基因结构
• 4.2.7 基因拷贝数
• 4.2.8 基因表达量
• 4.3 结论与讨论
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 上海交通大学学位论文答辩决议书