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HAX-1与c-Abl非受体酪氨酸激酶相互作用及其生物学意义

2020-11-29阅读(214)

HAX-1与c-Abl非受体酪氨酸激酶相互作用及其生物学意义

论文摘要

哺乳动物细胞内非受体酪氨酸激酶c-Abl在正常生理及病理条件下具有多种生物学功能,参与细胞增殖、细胞粘附、细胞凋亡、应激反应、细胞转化等过程的调控。前期研究以全长c-Abl为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选Hela细胞cDNA文库,获得一系列与c-Abl存在相互作用的蛋白,发现HAX-1有可能与c-Abl相互作用。HAX-1具有强的抗细胞凋亡作用,与细胞存活有关,并参与细胞运动及迁移,在功能上与c-Abl有一定的相关性,但对其功能调节的机理仍不清楚。本研究试图通过对二者的相互作用及在生物学功能方面的联系,为进一步阐明HAX-1与c-Abl在细胞凋亡及氧化应激反应发生发展的机制提供线索。本研究利用免疫共沉淀、免疫印迹、GST pulldown等方法证实HAX-1与c-Abl在细胞内外存在相互作用,c-Abl通过其SH3结构域与HAX-1 C末端150-176位氨基酸残基区域结合。通过抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹检测证实HAX-1促进c-Abl蛋白的酪氨酸磷酸化水平从而激活c-Abl的酪氨酸激酶活性。研究发现,HAX-1能够剂量依赖方式导致细胞内c-Abl蛋白水平下降,这种调节机制是不依赖于c-Abl蛋白的激酶活性,与HAX-1通过C端与c-Abl相互作用一致,HAX-1通过其C末端结构域调控c-Abl的表达。利用siRNA将HAX-1基因沉默,得到HAX-1敲低的细胞株MCF-7/HAX-1siRNA,发现该细胞中c-Abl蛋白水平增加,从而进一步证实HAX-1对c-Abl蛋白水平的调控作用。通过RT-PCR证实HAX-1不是在mRNA水平上对c-Abl蛋白表达进行调控;放线菌酮阻抑实验及Pulse-chase实验证实,在HAX-1过表达时,c-Abl的半衰期为3.31h,低于c-Abl在正常细胞中的半衰期（6.17h）,说明HAX-1主要通过促进c-Abl降解来调控细胞内c-Abl的蛋白质水平。通过蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测在有或无HAX-1存在条件下c-Abl蛋白表达变化量的差异,证实了HAX-1可以促进c-Abl通过蛋白酶体途径降解,最终导致细胞质及细胞核内的c-Abl蛋白水平下降。由于c-Abl通过P73参与细胞内凋亡作用。为研究HAX-1调节c-Abl蛋白水平的凋亡效应,应用凋亡诱导剂顺铂、IR,分别处理MCF-7/HAX-1siRNA及MCF-7（WT）细胞,流式细胞仪检测分析细胞凋亡率,发现在4mM顺铂处理12h,或者5GyIR处理后,MCF-7/HAX-1siRNA细胞表现较高的细胞凋亡;应用c-Abl激酶抑制剂STI571处理后,MCF-7/HAX-1siRNA细胞的凋亡率降低,提示HAX-1通过调节c-Abl蛋白水平参与细胞凋亡。由于ROS能够激活细胞质中c-Abl激酶活性,引起氧化应激反应,诱导细胞发生凋亡。本研究分别通过MTT细胞增殖实验、FACS检测了在H2O2诱导条件下,HAX-1与c-Abl蛋白在细胞增殖及凋亡中的功能及作用,发现HAX-1能够通过改变细胞内c-Abl激酶蛋白水平来抵抗H2O2诱导的细胞凋亡,使细胞能够耐受较高浓度的H2O2处理。通过DCFH-DA、Rhodamine 123等方法检测细胞内ROS水平及线粒体膜电位,证实HAX-1通过调控c-Abl的激酶活性及蛋白水平,参与细胞内ROS水平及线粒体膜电位的调节。应用GPx抑制剂BSO处理MCF-7/HAX-1siRNA及MCF-7（WT）细胞,表明GPx是受调控的直接参与ROS调控的主要蛋白质。本研究发现HAX-1与c-Abl激酶相互作用,增强c-Abl自身磷酸化水平,导致c-Abl激活,并促进c-Abl通过蛋白酶体途径降解,从而参与c-Abl调控的细胞凋亡及氧化应激反应。该研究对于深入认识HAX-1功能及c-Abl非受体酪氨酸激酶的调控机制具有重要的理论意义。

论文目录

  • 缩略词表
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 1. c-Abl 非受体酪氨酸激酶
  • 2. HAX-1 的结构与功能
  • 3. 本课题研究的科学问题
  • 材料与方法
  • 1. 菌株、细胞株及质粒
  • 2. 分子生物学工具酶
  • 3. HAX-1 全长基因的获得
  • 4. 引物设计、载体构建及序列测定
  • 4.1 真核表达载体Flag-HAX-1 及其突变体所用引物
  • 4.2 真核表达载体Myc-HAX-1 及其突变体所用引物
  • 4.3 原核表达载体GST-HAX-1 所用引物
  • 4.4 pSR-GFP-HAX-1siRNA 载体构建
  • 4.4 扩增HAX-1 特异性引物
  • 4.6 扩增c-Abl 特异性引物
  • 4.7 扩增人β-actin 特异性引物
  • 5. 转染质粒制备
  • 6. 细胞培养、冻存与转染
  • 7.谷胱甘肽 S 转移酶（Glutathion S-transferase, GST）融合蛋白制备
  • 8.免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）与免疫印迹（Immunoblot,IB）
  • 9. 体外结合实验
  • 10. 蛋白质浓度测定
  • 11. Pulse-Chase 实验
  • 12.细胞总 RNA 提取及 RT-PCR
  • 13. 细胞质、细胞核蛋白分离
  • 14. 细胞免疫染色
  • 15. 流式细胞技术检测细胞凋亡率
  • 16. 细胞增殖实验
  • 17.细胞内活性氧检测
  • 18. 其它
  • 结果
  • 1. HAX-1 与c-Abl 形成复合物
  • 2. c-Abl 通过SH3 和SH2 结构域与HAX-1 结合
  • 3.HAX-1 与 c-Abl 相互作用不依赖于 PXXP 基序
  • 4. c-Abl 通过SH3 结构域与HAX-1 C 端结合
  • 5.建立 HAX-1siRNA 稳定细胞株
  • 6. HAX-1 参与细胞内c-Abl 蛋白表达水平的调控
  • 6.1 HAX-1 下调细胞内c-Abl 蛋白表达水平
  • 6.2 HAX-1 依赖 C 端结构域下调 c-Abl 蛋白表达
  • 6.3 HAX-1 导致细胞质、细胞核内c-Abl 蛋白水平降低
  • 7. HAX-1 增强c-Abl 酪氨酸磷酸化水平
  • 8. HAX-1 调控细胞内 c-Abl 蛋白表达水平
  • 8.1 HAX-1 在转录后水平调节c-Abl 表达
  • 8.2 HAX-1 影响c-Abl 蛋白稳定性
  • 8.3 HAX-1 对c-Abl 蛋白水平的调节不依赖激酶活性
  • 8.4 HAX-1 通过蛋白酶体途径调节 c-Abl 蛋白水平
  • 9. HAX-1 通过c-Abl 实现抗细胞凋亡
  • 10. HAX-1、c-Abl 参与细胞氧化应激调节
  • 11. HAX-1、c-Abl 影响细胞内ROS 水平、线粒体跨膜电位
  • 讨论
  • 1. HAX-1 与c-Abl 之间的相互作用
  • 2. HAX-1 下调细胞内 c-Abl 蛋白表达
  • 3. HAX-1 增强细胞内c-Abl 酪氨酸磷酸化水平
  • 4. HAX-1 参与DNA 损伤诱导的细胞凋亡
  • 5. HAX-1 与 c-Abl 共同参与细胞氧化应激反应
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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