论文摘要
研究背景:移植排斥是角膜移植术失败的主要原因,尤其是植床上有大量新生血管的高危角膜移植患者,移植后排斥反应发生早且严重,移植物常被破坏。在局部或全身应用免疫抑制剂的情况下,角膜植片的存活率仍小于35%,这已成为目前亟待解决的问题。该反应是一多因素参与的复杂过程,影响因素具有广泛性和交叉性。目前大多数对角膜的基础研究多停留在单基因和基因组水平。但是,机体生理机能的真正执行者是蛋白质,有研究表明细胞内mRNA水平和蛋白质的表达峰度并不完全一致,因此从蛋白质水平对疾病进行研究显得特别重要。然而,传统的对单个蛋白质或某几种蛋白质进行研究的方式难以系统透彻地整体阐释角膜移植排斥反应的基本机制。要对移植排斥反应的复杂活动有全面深入的认识,必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。已有研究表明:对于角膜移植排斥反应的治疗,某些药物的全身疗效远远优于局部用药,这提醒我们考虑到总体宏观的观察角膜移植排斥反应:考虑角膜营养的来源以及血液循环对于排斥反应的影响。角膜本身无血管,其营养代谢主要来自于房水、泪膜和角膜缘血管网。上皮细胞的氧供来自泪膜,内皮细胞的氧供来自房水。能量物质主要是葡萄糖,大部分通过内皮细胞从房水中获取,约10%由泪膜和角膜缘血管供给。因此,我们可以得出结论:角膜自身状况的改变缘自于泪液、房水及血液成分的改变。同时,结合临床实际,对于角膜移植免疫排斥反应患者来说,泪液、房水及血清的采集、检测比角膜的采取更加安全可行。蛋白质组是一个基因组所能编码的所有蛋白的组合。蛋白质组学是对一个基因组、一种生物、一种细胞、组织所表达的全部蛋白质及其相互作用的研究,提供的资料更真实地反映基因、组织、器官的实际功能状态。蛋白质芯片-飞行时间质谱技术（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS）是蛋白芯片与表面加强激光解吸电离飞行质谱的技术组合。优越性主要表现在:可直接用未经纯化的样品进行分析;样品需求量少;灵敏度高;高通量。与角膜相关的蛋白质组研究在国际上处于起步阶段。泪液中很多蛋白质成分为外分泌蛋白,受眼局部因素及全身状态的双重影响。在一些眼病或者全身疾病的研究中,已发现泪液有特征性的蛋白质成分变化。泪液中的低丰度蛋白有相当部分具有重要的生理和病理意义。有研究表明:角膜移植术后,泪液中的IgG、sIgA、LF呈一规律变化曲线。当排斥反应发生时,IgG水平异常升高,LF水平呈下降趋势。检测泪液中的IG含量,有助于预防角膜移植排斥反应的发生和监测排斥反应是否治愈。还有研究表明急性排斥期房水白蛋白、H型细胞角蛋白和α-1抗胰蛋白酶成分明显升高,提示排斥期房水蛋白成分变化至少有三种机制:房水-血屏障的破坏、酶性降解和局部合成的蛋白释放入房水。但是,对于血清中蛋白质组的改变及与血清与角膜移植排斥反应的相关分析及研究尚未见报道。研究目的1.在原有动物模型基础上,改进大鼠角膜移植模型建立技术技巧,并以此为基础,从组织形态学方面验证并探讨角膜移植术后免疫排斥反应的发病机制;2.利用SELDI蛋白芯片技术检测发生与未发生角膜移植排斥反应的大鼠泪液、房水以及血清的标志蛋白表达;对照分析蛋白成分变化机制,建立诊断模型,并验证模型的特异性与敏感性;筛选角膜移植排斥反应相关蛋白并分析其与角膜免疫排斥反应相关的可能机制。研究方法1.建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,Wistar大鼠20只为供体,SD大鼠40只为受体,行SD大鼠右眼同种异体穿透性角膜移植,术中,Ⅰ组从角膜旁中心取植片,缝线保留长度约1mm,Ⅱ组取角膜中心植片,缝线尽量剪短;2.术后大鼠随机分为2组,每组20只。分别为Ⅰ组排斥组（生理盐水对照组）,Ⅱ组非排斥组（CsA滴眼液、典比殊滴眼液点眼）。术后第1天开始起在裂隙灯显微镜下进行临床观察,对角膜混浊、水肿、新生血管三项指标进行评分。所得数据以means±SD表示,应用SPSS13.0统计软件包进行处理。统计方法:独立样本t检验（Independent-Sample T Test）,P＜0.05有统计学意义;3.两组均于术后第7天随机取2只大鼠角膜,HE染色及常规透射电镜观察;4.同时采集其他大鼠血液、泪液、房水。取血后血液在冰上静置1h,0℃离心5000r/min 10min。分离血清,与泪液、房水一并冻存于-80℃以备后用;5.将每组18例泪液、房水标本及16例血清标本（每组有2例血清标本发生冻融,放弃）随机分为2组。取其中一组用于蛋白质决策树模型的建立:应用WCX2蛋白芯片捕获蛋白,蛋白质离子化后,用PBS IIC型蛋白质芯片阅读机对不同组泪液、房水及血清蛋白进行检测,获得各样本的蛋白指纹图谱。采用Ciphergen Biosystems公司的Ciphergen ProteinChip 3.0版本机带分析软件自动采集数据,采用Biomarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质以基于最小Gini指标方法建立决策树模型,然后以10折交叉验证法（10-fold Cross-validationEstimates）进行决策树评估,找出区分两组样本能力最强的蛋白质组合;6.用另外一组标本盲法检测该模型的敏感性及特异性;7.在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白质库中对标志蛋白进行初步筛选。结果:1.2组大鼠术后角膜转归情况都按预期发展,标本采集过程对大鼠角膜及全身情况没有影响;2、根据大鼠同种异体穿透性角膜移植术后评分,确定在术后第7天时Ⅰ组排斥组大鼠已经发生角膜移植排斥反应,而Ⅱ组未排斥组大鼠没有发生角膜移植排斥反应;3.HE染色发现角膜植片上皮基底细胞形成很多空泡,间质结构疏松,大量炎性细胞浸润,主要存在于上皮层和浅层基质。基质层可见新生血管官腔;4.透射电镜发现排斥反应发生的角膜上皮层层次紊乱,表层细胞微绒毛消失,细胞超微结构不明显,细胞间桥粒纤维化,含丰富糖原颗粒;固有层胶原微纤维平行排列规律性消失,细胞核浓缩,染色质边集,核膜不清,部分消失,周围超微结构不清,残留内质网扩张及丰富糖原堆积,固有层胶原角化,可见脂滴;5.在分子量1000—20000 Da范围内:5.1泪液5.1.1泪液排斥与非排斥组中共有108个蛋白质被标记,其中有分类价值的标志蛋白质有11种,相对分类价值较高的有6种,其中M2167.66、M3356.53在排斥反应组中表达下调,M1169.86、M1183.69、M9238.59、M11882.2在排斥反应组中表达上调;5.1.2盲法检测结果,该决策树模型敏感性为78%,特异性为89%;5.1.3蛋白质搜库结果提示相关蛋白可能是下调蛋白:Pro-histogranin、胰高血糖素样肽1（GLP-1）;上调蛋白:β-防御素2、细胞凋亡蛋白酶-3（Caspase-3）亚基、神经激肽A（NKA）;5.2房水5.2.1房水排斥与非排斥组中共有87个蛋白质被标记,其中相对分类价值较高的蛋白质有6种,分别为M1037.98,M1436.29,M1326.12,M1082.37,M1067.86,M11261.6并且在排斥反应组中表达上调;5.2.2盲法检测结果:该决策树模型敏感性为67%,特异性为78%;5.2.3蛋白质搜库结果提示相关蛋白可能是血管紧张素-1（AGT-Ⅰ）、血管紧张素-2（AGT-Ⅱ）、神经肽、转化生长因子TGF-β;5.3血清5.3.1血清排斥与非排斥组中共有58个蛋白质被标记,其中相对分类价值较高的蛋白质有6种,分别为M8809.89,M7010.01,M4420.15,M3507.18,M4151.08,M1706.30并且在排斥反应组中表达上调;5.3.2盲法检测结果:该决策树模型敏感性为75%,特异性为75%;5.3.3蛋白质搜库结果提示相关蛋白可能是神经肽Y,β-抵抗素、高血糖素、、Cortistatin（CST）。结论:1.通过对建立大鼠穿透性角膜移植动物模型技术的改进以及标本采集方法的探讨,整理出一套行之有效的建立模型以及标本采集的操作规程;保留缝线和钻取植片部位等方法可以影响角膜移植术后的转归;2.术后第7天是大鼠角膜术后发生移植排斥组与未发生排斥组的分界点。是术后取材的时间点;3.大鼠角膜移植术后临床观察表现评估与HE染色组织形态学观察结果相符;4.透射电镜结果表明已发生排斥反应的角膜植片超微结构特征表现为细胞凋亡和细胞坏死共存。由此我们推断,细胞凋亡的确参与了角膜移植急性排斥反应的发生;5.应用SELDI-TOF-MS技术获得大鼠角膜移植后泪液、房水、血清标志蛋白表达图谱的实验方法稳定可行,检测出的泪液、房水、血清中的生物标记物可正确区分排斥与非排斥组大鼠;6.Pro-histogranin可能通过转化为histogranin,β-防御素通过参与直接及间接的免疫激活作用,CST通过刺激单核细胞的分化和激活参与角膜移植术后免疫排斥反应;7.我们的试验结果表明在泪液、房水、血清的标志蛋白表达中均有神经肽的上调表达。这提示我们在角膜的免疫排斥反应的后续研究中考虑神经递质是否通过刺激单核细胞的分化和激活参与机体的免疫调节,从而影响角膜移植免疫排斥反应,考虑神经系统在角膜移植免疫排斥反应中的地位和作用。创新1.规范化建立了大鼠角膜移植模型建立以及标本采集的操作规程;2.应用SELDI-TOF-MS技术获得大鼠角膜移植后泪液、房水、血清蛋白质标志蛋白的表达图谱;3.提出神经肽可能通过刺激单核细胞的分化与激活参与机体的免疫调节,影响角膜移植免疫排斥反应。