毛竹再生体系构建的初步研究

论文摘要

毛竹是我国竹子中最重要的竹种,栽培面积最大和经济效益最好,但其生物学特性导致种质资源创新困难。近年来随着竹产业迅速发展和转基因技术日益成熟,适合毛竹工业化利用的无性系创制在技术上和产业化上成为可能,稳定的再生体系构建是毛竹转基因育种不可缺少的技术平台。本研究通过对竹笋、种胚等外植体材料进行了种胚消毒、愈伤组织诱导、增殖、分化及悬浮培养、细胞学观察等研究,结论如下:1.毛竹鞭笋、冬笋、春笋等外植体消毒较容易,选择箨包裹紧实的笋体,经过75%乙醇消毒后在超净台下剥取无菌部分就可以获得满意的无菌得率,无菌得率高达95%以上,偶有个别细菌污染。种胚消毒较困难,次氯酸钙类消毒剂对种子活力影响明显,抗生素消毒效果差不能杀死种子上的微生物,过氧化氢也不适合种胚消毒,以0.1%升汞消毒效果最好。毛竹种胚最佳的消毒处理为:种胚预处理,去掉尾部容易污染部分,浸种12h后,采取0.1%升汞消毒20min,无菌水漂洗10遍。这样可以获得较为满意的消毒效果,污染基本为一种单一真菌污染,极少有细菌和其他杂菌污染,可能是附着在种胚表面的优势真菌导致消毒困难。隔年陈种子因生活力显著下降一般不宜作为外植体,种子采集时间早种胚尚未发育完全,污染率低同时种胚发芽率也低。不同温度的热处理对种子活力影响很大,种子几乎全部丧失生活力,同时对改善严重污染没有帮助作用。2.毛竹笋（鞭笋、冬笋、春笋等）及笋箨外植体诱导愈伤组织较易,诱导率高达100%,但质量不高,没有获得紧实的胚性愈伤组织,愈伤组织水渍化严重,继代培养时严重褐变,各种措施均无法挽救,细胞学检查表明多数细胞缺失细胞核。放置方式和切割方式对愈伤组织诱导没有影响,接触培养基部分容易产生愈伤组织;在诱导速度上春笋较快,鞭笋次之,冬笋反应相对较慢。毛竹种胚诱导的愈伤组织可以分为两种类型,一类是紧实的胚性愈伤组织,一类是疏松的非胚性愈伤组织。切割方式对愈伤组织诱导的影响明显,横切方式由于切除了种胚的胚根组织,对控制胚根部位产生疏松易褐变愈伤组织有帮助,更容易产生胚性愈伤组织;在两种放置方式中,盾片朝下接触培养基能够获得较高的愈伤组织诱导率。胚性愈伤组织一般产生在根茎结合部位或者盾片部位,颜色淡黄色,用镊子夹取时感觉紧实;非胚性愈伤组织一般源自根部,颜色发白或紫褐色,松软,用镊子夹取易碎,水渍状明显。3.毛竹笋（包括春笋、冬笋、鞭笋及其笋箨）诱导的愈伤组织分化培养中容易褐变,在各种条件下均没有出现分化迹象,其增殖培养也不成功。在种胚诱导的愈伤组织中,因含有胚性愈伤组织,尚有个别出现分化迹象,但没有获得再生植株,增殖培养中,除个别非胚性愈伤组织能够实现正常增殖外,胚性愈伤组织存在褐变严重,生长速度慢,对各种培养条件调整不敏感,无论转接与否,胚性愈伤组织都不可逆朝着死亡褐变方向发展。按照存活数统计,脯氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、椰乳等有机添加物可以提高存活数,但酵母效果不明显,笋汁添加反而使存活数下降;糖的种类对愈伤组织影响不是很大,除甘露糖之外,葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖对愈伤组织存活影响相差无几。培养基中除N6培养基效果较差外,MS、CC、WC、NB、KM8P等培养基对愈伤组织继代培养影响效果相当。4.毛竹非胚性愈伤组织的悬浮培养结果表明,培养基中2,4-D浓度变化对愈伤组织增殖影响不是很大,愈伤组织在悬浮培养液中需要长达12d增殖速度才变快,接种量虽能使愈伤组织增殖提前,但效果不明显,研究发现毛竹非胚性愈伤组织对外界条件反应不敏感且在悬浮培养条件下增殖速度慢。5.细胞学观察结果表明,在毛竹几种不同的愈伤组织中,可以看到无论是春笋、冬笋还是鞭笋,诱导出来的愈伤组织都很难观察到细胞核,细胞较大,呈长而弯曲状,呈指状,排列疏松。多数细胞缺乏细胞核可能是导致这种类型愈伤组织不能继代增殖的原因。种胚诱导出来的两种类型愈伤组织有所区别,紧实型胚性愈伤组织显微观察显示细胞体积小,细胞核大,细胞中液泡小,排列紧密。疏松型非胚性愈伤组织显微观察显示细胞体积较大,细胞核少,排列疏松。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 国内外研究现状与评述
• 1.2.1 国内外研究现状
• 1.2.2 研究评述
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.4 研究技术路线
• 第二章 研究材料与方法
• 2.1 外植体消毒
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 愈伤组织诱导
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 愈伤组织增殖分化
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.2 试验方法
• 2.3.3 培养基
• 2.3.4 数据统计
• 2.4 愈伤组织悬浮培养
• 2.4.1 试验材料
• 2.4.2 培养基
• 2.4.3 试验方法
• 2.5 不同愈伤组织的显微观察
• 2.5.1 试验材料
• 2.5.2 试验方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 外植体消毒
• 3.1.1 试验结果
• 3.1.2 试验分析
• 3.1.3 小结
• 3.2 愈伤组织诱导
• 3.2.1 试验结果
• 3.2.2 试验分析
• 3.2.3 小结
• 3.3 愈伤组织增殖与分化
• 3.3.1 试验结果
• 3.3.2 试验分析
• 3.3.3 小结
• 3.4 愈伤组织悬浮培养
• 3.4.1 试验结果
• 3.4.2 试验分析
• 3.4.3 小结
• 3.5 不同愈伤组织显微观察
• 3.5.1 试验结果
• 3.5.2 试验分析
• 3.5.3 小结
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 外植体消毒
• 4.1.2 愈伤组织诱导
• 4.1.3 愈伤组织继代增殖分化
• 4.1.4 愈伤组织悬浮培养
• 4.1.5 愈伤组织细胞学观察
• 4.2 讨论
• 4.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢