Cry基因遗传转化甘蔗的研究

论文摘要

甘蔗螟虫是一种普遍发生且严重危害甘蔗的鳞翅目害虫,造成产量和蔗糖分明显降低,加上螟虫种类多,世代重叠严重,使危害加剧,严重的蔗区只能种一季新植而不能宿根,使生产成本明显提高。目前,我国主要采用化学防治,既污染环境又增加了成本。培育和种植抗虫品种是防治蔗螟最经济、有效和环境友好的措施。但是,通过杂交培育抗螟虫甘蔗品种非常困难,原因在于几乎没有发现抗性的亲本。目前,基因工程技术被认为是改良甘蔗抗螟虫性状最佳的途径。为此,本研究拟通过转cry基因甘蔗植株的研制,最终培育抗螟虫的品种。主要研究结果:（1）成功构建了两个完整植物表达载体pUBCG0229和p2AST2301。其中:pUBCG0229载体共8,602 bp,带有抗虫基因cryⅠA（c）和抗除草剂的bar基因,bar基因既可作为筛选标记基因,又可作为甘蔗生产上有用的抗逆基因;p2AST2301载体共15,354 bp,带有抗虫基因cryⅡA和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。（2）建立了福农95-1702、桂糖94-119和桂糖96-44三个甘蔗品种在愈伤组织分化成苗和幼苗生根阶段的筛选体系,两个筛选阶段使用的PPT浓度分别为0.5 mg/L～0.75 mg/L和0.75 mg/L～1.0 mg/L。不同基因型间有一定差异,使用的PPT浓度不同。对于较大的群体,可在幼苗移栽成活后喷施3.0‰的Basra进行二次筛选;甘露糖浓度两个阶段分别为3g/L和6g/L,即甘露糖占总糖的30%。（3）明确了几个影响外源DNA导入农杆菌EHA105效率的因素,在制备感受态细胞时,EHA105菌液的OD600值最适范围应在1.0～1.5之间,CaCl2浓度6 mmol/L～10 mmol/L均无显著差异,其中以10 mmol/L效果最佳,转化率达5.322×106;虽然在37℃时转化率最高,达5.550×106,但热击温度在20℃～37℃无显著差异,（4）采用基因枪轰击法,将cryⅠA（c）基因成功导入甘蔗品种福农95-1702、桂糖94-119和桂糖96-44中,已获得三个品种共21株PCR检测呈阳性且有4株经基因组DNA Dot-Southern杂交检测呈阳性的转基因植株,编号分别为:FGMSc06-22,FGMSc06-24,FGMSc06-28和FGMSc06-31。研究结果具有一定的理论意义和重要的实践价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 基因工程技术与作物抗虫性改良
• 1.1.1 抗虫基因及其应用
• 1.1.2 Bt基因类型及其表达产物的杀虫机理和杀虫谱
• 1.1.3 利用Bt基因改良作物抗虫性的现状
• 1.2 甘蔗螟虫及其治理现状
• 1.2.1 甘蔗螟虫的种类及特点
• 1.2.2 甘蔗螟虫的危害与治理现状
• 1.3 基因工程技术与甘蔗品种改良
• 1.3.1 甘蔗转基因改良的优势
• 1.3.2 甘蔗转基因改良的方法
• 1.3.3 甘蔗基因工程中的筛选标记
• 1.3.4 甘蔗抗虫性转基因改良的现状
• 1.3.5 甘蔗其它性状转基因改良的现状
• 1.3.6 甘蔗转基因改良存在的主要问题
• 1.4 本研究的目的意义和思路
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 植物受体材料
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 试剂和耗材
• 2.1.5 所用检测引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.2 供试植物材料的准备
• 2.2.3 除草剂抗性筛选体系的建立
• 2.2.4 甘露糖抗性筛选体系的建立
• 2.2.5 基因枪法转化甘蔗
• 2.2.6 农杆菌菌株EHA105生长曲线的建立
• 2.2.7 植物表达载体导入农杆菌
• 2.2.8 农杆菌介导法转化甘蔗
• 2.2.9 抗性植株的分子鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.2 甘蔗胚性愈伤组织的诱导及再生植株的获得
• 3.3 甘蔗再生体系的抗性预试验
• 3.3.1 甘蔗对除草剂的敏感性
• 3.3.2 甘蔗对甘露糖的敏感性
• 3.4 基因枪轰击法转化甘蔗及筛选结果
• 3.4.1 外源DNA的准备和验证结果
• 3.4.2 基因枪轰击转化及抗性植株的获得
• 3.5 农杆菌菌株EHAl05生长曲线的建立
• 3.6 植物表达载体导入农杆菌
• 2浓度对感受态细胞质量的影响'>3.6.1 CaCl₂浓度对感受态细胞质量的影响
• 3.6.2 热激温度对植物表达载体导入农杆菌的影响
• 3.7 农杆菌介导法转化甘蔗及抗性筛选
• 3.8 抗性植株的分子鉴定
• 3.8.1 基因组DNA的质量
• 3.8.2 PCR检测结果
• 3.8.3 农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心检测
• 3.8.4 Dot-Southern检测结果
• 3.8.5 阳性植株PCR产物测序结果
• 4 讨论
• 4.1 关于甘蔗遗传转化中筛选标记基因的选择问题
• 4.1.1 关于除草剂筛选标记
• 4.1.2 关于甘露糖筛选标记
• 4.2 关于甘蔗遗传转化中筛选技术体系的建立
• 4.3 关于农杆菌介导的甘蔗遗传转化
• 4.4 关于后续工作
• 5小结
• 5.1 构建了两个分别带有cryⅠA（c）和cryⅡA基因的植物表达载体
• 5.2 初步建立了三个甘蔗基因型的PPT及甘露糖筛选体系
• 5.3 明确了外源DNA导入农杆菌EHA105时的几个因素条件
• 5.4 获得了转cryⅠA（c）基因的甘蔗株系
• 参考文献:
• 附录Ⅰ 农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心检验结果报告书
• 附录Ⅲ 缩略词及英汉对照
• 附录Ⅲ MS培养基配方及其母液的配制
• 附录Ⅳ 主要溶液的配制
• 致谢