首页> 正文

蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性

2020-12-11阅读(951)

蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性

论文摘要

来源于超嗜热古菌Aeropyrum pernix K1酰基氨酰肽酶（APE1547）是具有酰基肽酶/酯酶等活性的多功能（promiscuous）酶,具有超常的生物学稳定性。本课题组在前期研究中,通过定向进化的方法,获得了酯酶活性提高的突变体P01（R526V）,对系列对硝基苯酚酯底物表现良好的酯酶水解活性,最适酰基链长底物为对硝基苯酚辛酸酯（pNP‐C8）。本文结合定向进化与半理性设计的蛋白质工程方法和溶剂工程技术,增加该酶对长链酰基底物的活性和选择性,并对酶活性和底物选择性与酶细微结构之间的关系进行了深入的分析。采用的研究方法和取得的结果如下:1、以P01为出发酶,应用非理性的定向进化方法,对其催化结构域基因进行易错PCR后与推进器结构域连接,转化BL21菌,在多重选择压力下（高温及不同长度碳链的底物）,应用优化的高通量筛选方法,筛选了万余株突变体,发现1个远离活性中心18.2（?）的关键位点T560,得到突变体E01（R526V/T560W）。催化动力学分析发现:E01对pNP‐C12的亲和力（1/Km值）是P01的9.7倍,转化数（kcat值）是P01的1.5倍,因此催化效率(kcat/Km值)是P01的14倍,表明对底物特异性的提高主要的原因是提高了对pNP‐C12的亲和力。将P01分子与不同链长底物作模拟通道对接（SLITHER）,发现T560位于次要底物通道的入口处,突变为W后,通道变得狭窄,阻碍了pNP‐C12的进入。结构分析表明,酶的推进器结构域中以及推进器结构域与催化结构域之间存在两条通道,推测由于改善了pNP‐C12在酶分子内部的交通,而使催化效率明显提高。此外,T560W突变使酶的80℃半衰期由123小时下降为77小时（酶浓度0.8mg/ml）。结构分析表明,Thr560的侧链O与563的主链NH之间形成氢键对局部构象的稳定性有重要作用,突变破坏了这一氢键,可能是热稳定性下降的原因之一。2、以E01为出发酶,根据底物与E01活性中心的分子对接结果,应用半合理设计的方法,选择11个底物结合部位的残基（3个活性位点附近残基Y444、Y446、Y449和8个底物口袋处的残基P370、E419、W474、M477、F485、F488、I489、T527）进行饱和突变,在多重选择压力下（高温及不同长度碳链的底物）的高通量筛选,发现了2个关键位点W474和F488,对酶的酰基链长选择性和活性有显著影响。并获得3个突变体:S01（F488G/R526V/T560W）、S02（F488P/R526V/T560W）和S03（W474V/R526V/T560W）。它们对pNPC12的kcat/Km值分别是P01的4.5、4.6和21倍,kcat值分别是P01的3、1.5和4倍。应用同源模建和底物对接,对F488和W474位点影响底物选择性和活性的机制进行了分析。F488位点位于底物结合口袋的侧壁,突变为G后,底物结合口袋体积扩大为577（?）3,推测更利于容纳长链酰基;W474位点位于底物口袋的底部,突变为V后,底物结合口袋的深度由6.07（?）延长为11.4（?）左右,同时该口袋的疏水性增强,有利于长链酯底物的进入与定位,因而提高了活性。为证实结构分析的合理性,通过理性设计,分别获得了E01基础上的突变F488→S、A、Y、W和突变W474→A、Q和双点突变W474V/F488G连同饱和突变筛选得到的F488G、F488P和W474V共12种突变体酶,分别测定催化动力学参数,与相应氨基酸侧链理化性质作二维构效分析,其结果支持结构分析的结论。理性设计得到的D01（W474/F488G/ R526V/T560W）性质最优,对pNPC12的kcat/Km值是P01的24倍,kcat值是P01的5倍。3、溶剂工程是通过改变介质环境来达到调节酶活性和底物选择性的重要技术。选择乙腈、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺作为研究对象,分别建立了反应体系,研究了野生型酶和各种突变体在水/有机共溶反应体系中对不同底物的催化反应,发现三个带有F488G和W474V的突变体在低浓度有机溶剂中的催化特征与WT、P01和E01存在显著的不同。随着有机助溶剂浓度的提高,S01、S03和D01的活性有明显的提高,而WT、P01和E01的活性却受到强烈的抑制。在10%乙腈、30%二甲基亚砜和20%二甲基甲酰胺中,最佳突变体D01与WT相比,活性分别提高240倍、99倍和280倍。有机溶剂对S01、S03和D01的底物选择性也有明显增强,其中最佳突变体D01在10%乙腈、30%二甲基亚砜和20%二甲基甲酰胺中,对pNPC12/ pNPC4的选择性增加了12、18、和19倍。分析发现酶在乙腈溶剂中的C50与F488残基的疏水性参数呈正相关性（R2=0.946）。在10%乙腈中的模拟分子动力学也发现乙腈分子可以渗透进入活性中心,而且突变后的G488附近有乙腈分子留滞的现象。推测该激活现象是由于有机溶剂分子渗入酶活性中心,进入了F488G和W474V突变产生的空穴,使催化部位的微环境发生改变,因而改变了酶的催化效率。本论文对酶本身及酶反应溶剂体系的优化进行了系统的探索。研究表明:1、APE1547对酯底物的选择性与底物通道、底物结合口袋关键氨基酸理化性质、催化中心的微环境密切相关。2、酶的分子改造与溶剂工程相结合,是改变酶底物选择性的有效手段,对酶分子改造和应用具有很好的借鉴意义。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 嗜热酶
  • 1.1.1 嗜热菌的发现
  • 1.1.2 嗜热酶及其应用
  • 1.2 嗜热酯酶
  • 1.2.1 酯酶
  • 1.2.2 嗜热酯酶
  • 1.2.3 嗜热酶APE1547 的结构和催化机制
  • 1.3 酯酶的结构与其底物特异性和活性的相关性研究
  • 1.3.1 活性中心的位置
  • 1.3.2 底物结合口袋和活性中心的静电环境
  • 1.3.3 底物结合口袋的疏水性
  • 1.3.4 底物结合口袋的体积和形状
  • 1.4 蛋白质工程方法
  • 1.4.1 理性设计
  • 1.4.2 非理性设计
  • 1.4.3 半理性设计
  • 1.5 水-有机溶剂互溶体系中的酶学和蛋白质工程进展
  • 1.5.1 溶剂工程
  • 1.5.2 水-有机溶剂互溶体系对酶促水解反应的影响
  • 1.5.3 水-有机溶剂互溶体系对酶构象和稳定性的影响
  • 1.5.4 水-有机溶剂互溶体系对酶活性和底物特异性的影响
  • 1.6 本论文的立论依据和设计思路
  • 第二章 嗜热酯酶催化结构域的定向进化
  • 2.1 序言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌种和质粒
  • 2.2.2 主要试剂
  • 2.2.3 主要仪器
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 试剂的配制
  • 2.3.2 软件
  • 2.3.3 随机突变库的构建和筛选
  • 2.3.4 酶的制备和纯化
  • 2.3.5 蛋白浓度测定
  • 2.3.6 酶学性质分析
  • 2.3.7 分子动力学分析
  • 2.4 实验结果
  • 2.4.1 随机突变库的构建
  • 2.4.2 随机突变库的高通量筛选
  • 2.4.3 酶的纯化结果
  • 2.4.4 最适温度变化
  • 2.4.5 T560W 突变对酶的热稳定性影响
  • 2.4.6 突变体E01 的最适pH
  • 2.4.7 底物特异性及催化动力学常数的测定
  • 2.4.8 SLITHER 计算T560W 突变对次要通道的影响
  • 2.4.9 分子动力学分析T560 位点的突变对催化三联体的影响
  • 2.5 讨论
  • 2.5.1 随机突变库的筛选与必要库容量
  • 2.5.2 影响筛选结果的因素及相应对策
  • 2.5.3 远离活性中心的突变对酶的影响
  • 2.5.4 如何理解Slither 预测的结果--T560W 突变对次要通道的影响
  • 2.6 小结
  • 第三章 对活性中心非保守残基和底物结合口袋的半理性设计
  • 3.1 序言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 菌种和质粒
  • 3.2.2 主要试剂
  • 3.2.3 软件
  • 3.2.4 仪器
  • 3.2.5 溶液配制
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 GxSxG 基序的同源序列比对
  • 3.3.2 底物结合部位残基的确定
  • 3.3.3 对特定位点的结构分析
  • 3.3.4 饱和突变库的建立
  • 3.3.5 饱和突变库的筛选
  • 3.3.6 酶的纯化
  • 3.3.7 酶的性质表征
  • 3.3.8 突变体酶的模建与底物结合口袋分析
  • 3.4 结果
  • 3.4.1 同源序列比对
  • 3.4.2 底物结合部位饱和突变位点的选择
  • 3.4.3 筛选饱和突变库的结果
  • 3.4.4 复筛结果
  • 3.4.5 突变体序列测定
  • 3.4.6 Y444、Y446 和Y449 残基三级结构分析
  • 3.4.7 突变体酶的热稳定性
  • 3.4.8 突变体酶的最适温度
  • 3.4.9 突变体酶的最适pH
  • 3.4.10 突变体活性和底物特异性测定结果
  • 3.4.11 反应动力学常数的测定
  • 3.5 讨论
  • 3.5.1 GxSxG 基序的非保守残基的保守性
  • 3.5.2 HG 基序附近的370 位点对活性的影响及原因分析
  • 3.5.3 底物结合部位残基对酶的底物选择性的影响
  • 3.5.4 F488G、F488P 和W474V 突变对E01 其它性质的影响
  • 3.5.5 探测“可塑性”残基的意义
  • 3.6 小结
  • 第四章 474、488 位点氨基酸性质对催化活性的影响
  • 4.1 序言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 菌种和质粒
  • 4.2.2 主要试剂
  • 4.2.3 主要仪器
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 试剂的配制
  • 4.3.2 软件
  • 4.3.3 定点突变
  • 4.3.4 突变位点的鉴定
  • 4.3.5 突变质粒的转化和突变体酶的表达、纯化
  • 4.3.6 突变体酶的性质表征
  • 4.4 结果
  • 4.4.1 突变质粒的测序鉴定
  • 4.4.2 酶的各种催化活性
  • 4.4.3 位点488 和474 对最适pH 的影响
  • 4.4.4 位点488 和474 对酶最适温度的影响
  • 4.4.5 各突变体酶的催化动力学常数
  • 4.4.6 488 残基对酰基口袋的形状和体积的影响
  • 4.4.7 488 残基对底物对接的影响
  • 4.4.8 474 位点对酰基口袋形状和体积的影响
  • 4.4.9 474 位点对底物对接的影响
  • 4.4.10 W474V/F488G双突变对底物对接的影响
  • 4.5 讨论
  • 4.5.1 嗜热酶APE1547 从多能型向酯酶专一性的进化
  • 4.5.2 结构分析和催化动力学分析的结合应用
  • 4.6 小结
  • 第五章 溶剂工程研究
  • 5.1 序言
  • 5.2 实验材料
  • 5.2.1 菌种和质粒
  • 5.2.2 主要试剂
  • 5.2.3 主要仪器
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 试剂的配制
  • 5.3.2 软件
  • 5.3.3 酶的制备与纯化
  • 5.3.4 极性有机溶剂浓度对突变体底物特异性和活性的影响
  • 5.3.5 分子动力学模拟
  • 5.4 实验结果
  • 5.4.1 各种低浓度有机溶剂对S01 的影响
  • 5.4.2 乙腈浓度对不同突变体酶活性的影响
  • 50 值'>5.4.3 各突变体对乙腈的C50值
  • 50 值的相关性'>5.4.4 488 位点氨基酸疏水性与乙腈的C50值的相关性
  • 5.4.5 有机溶剂对酶活性的影响
  • 5.4.6 有机溶剂对底物特异性的影响
  • 5.4.7 分子动力学模拟结果
  • 5.5 讨论
  • 5.6 小结
  • 参考文献
  • 论文创新点
  • 研究展望
  • 附录
  • 附录一. APE1547 C 端催化结构域的拓扑结构
  • 附录二. APE1547 的二级结构
  • 附录三 氨基酸的单字母、三字母缩写和英文全称
  • 附录四氨基酸残基的性质
  • 作者简历
  • 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
  • 参与课题?
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].微课在蛋白质工程教学中的应用[J]. 现代医药卫生 2019(17)
    • [2].蛋白质魔术师:为多个行业打开新市场的蛋白质工程公司[J]. 智慧健康 2018(18)
    • [3].蛋白质工程技术在生物药物研发中的应用研究[J]. 生物化工 2017(03)
    • [4].生物药物研发应用蛋白质工程技术的分析[J]. 生物技术世界 2015(10)
    • [5].“例证法”在“蛋白质工程”教学中的应用[J]. 中学生物学 2017(08)
    • [6].“蛋白质工程的崛起”教学设计[J]. 中学生物学 2015(04)
    • [7].生物药物研发应用蛋白质工程技术探讨[J]. 科学中国人 2016(24)
    • [8].解读“蛋白质工程”[J]. 新高考(高三理化生) 2011(Z1)
    • [9].浅谈蛋白质工程[J]. 新课程学习(中) 2011(04)
    • [10].走进蛋白质工程[J]. 高中生学习(高二版) 2011(03)
    • [11].恩师郭礼和[J]. 中国细胞生物学学报 2020(06)
    • [12].基于雨课堂的蛋白质工程教学模式改革实践探索[J]. 广东化工 2019(14)
    • [13].蛋白质工程实验指南[J]. 应用与环境生物学报 2011(02)
    • [14].蛋白质工程技术及其在生物药物研发中的应用[J]. 药学进展 2011(12)
    • [15].基因工程与蛋白质工程综合性实验实施情况调查与分析[J]. 卫生职业教育 2016(07)
    • [16].蛋白质工程课程教学改革的实践与启示[J]. 海峡科学 2019(03)
    • [17].纤维素酶的蛋白质工程改造的研究进展[J]. 安徽农学通报(上半月刊) 2011(15)
    • [18].基于专利分析的蛋白质工程技术发展研究[J]. 数学的实践与认识 2019(01)
    • [19].“多元化”研究性教学在蛋白质工程教学中的改革与探索[J]. 生命的化学 2019(01)
    • [20].蛋白质工程：从定向进化到计算设计[J]. 生物工程学报 2019(10)
    • [21].科学出版社新书[J]. 中国生物工程杂志 2011(03)
    • [22].蛋白质工程技术探讨为什么嗜热酶的活性相对较低[J]. 生物医学工程与临床 2011(03)
    • [23].多民族地区蛋白质工程课程教学改革[J]. 高师理科学刊 2018(10)
    • [24].蛋白质工程手段修饰干扰素的实际应用研究进展[J]. 国外医药(抗生素分册) 2011(04)
    • [25].酶工程双语教学的实践与思考[J]. 科技经济导刊 2020(33)
    • [26].蛋白质工程发展的现实意义[J]. 信息化建设 2016(03)
    • [27].生物药物研发应用蛋白质工程技术的探讨[J]. 中国食品 2018(21)
    • [28].综合性实验过程性评价体系的构建初探——以基因工程与蛋白质工程综合性实验为例[J]. 中国现代教育装备 2016(13)
    • [29].浅议生物药物研发中对于蛋白质工程技术的应用[J]. 科技风 2019(05)
    • [30].浅议生物药物研发中对于蛋白质工程技术的应用[J]. 化工管理 2020(02)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5