基于树状高分子的生物样品中磷酸肽检测研究

论文摘要

蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它调节着细胞的信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动,也被形象地描述为细胞生理活动的开关。目前已知有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。因此,对蛋白质磷酸化的研究有助于全面理解蛋白质的各项功能及机理。蛋白质磷酸化的研究方法是先将蛋白质酶解,然后利用质谱对磷酸肽的氨基酸序列和磷酸化位点进行准确地鉴定。但磷酸肽的离子化效率差,而且非磷酸肽的存在也抑制磷酸肽的质谱信号,这些原因导致利用质谱直接对磷酸肽进行分析面临很大困难。因此在质谱分析前需要对磷酸肽进行特异性富集。本论文成功合成了树状聚合物-硅胶固相载体材料,利用固定金属离子亲和色谱技术对树状聚合物-硅胶固相载体材料的表面修饰固定Ti4+离子,固定金属离子亲和色谱技术是通过键合在鳌合底物上的金属离子特异性地与磷酸化肽相结合,并且在高pH中可以释放出磷酸化肽,从而实现其与非磷酸化肽的分离,由于树状聚合物的表面是多枝状结构,且含有大量的氨基,氨基吸附Ti4+具有很好的稳定性,并考察了其对磷酸肽的富集效果。利用标准磷酸化蛋白P-casein对其富集效率进行评价。实验中对富集条件进行优化,上样液中有机溶剂的浓度为50%的乙腈、酸的种类为三氟乙酸、浓度为0.1%、清洗次数为1次和洗脱液为0.4mol/L氨水,结果表明此方法对磷酸肽有较高的选择性,且检测限达到10-9mol/L。模拟复杂的生物样品,利用β-casein与BSA摩尔比为1：100的混合酶切溶液,考察了Ti4+-树状聚合物-硅胶材料的选择性。在优化的实验条件下,将所建立的富集条件和质谱鉴定方法用于牛奶样品中磷酸肽的富集和分析,鉴定到的牛奶中磷酸肽的序列覆盖率100%。结果表明,Ti4+-树状聚合物-硅胶材料对磷酸肽的分离富集具有很好的效果。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 蛋白质组学研究历史和背景

1.1.1 磷酸化蛋白质组学概述

1.1.2 蛋白质组学特点与难点

1.2 磷酸化蛋白鉴定

1.2.1 生物体内蛋白质磷酸化修饰及其功能

1.2.2 磷酸化蛋白质富集与分离

1.3 磷酸化肽富集和分离

1.3.1 化学修饰法

1.3.2 液相色谱法

1.3.3 固相金属亲和色谱

1.3.4 金属氧化物亲和色谱

1.4 磷酸肽识别

1.4.1 MALDI-TOF-MS结合磷酸酶水解分析法

1.4.2 PSD-MALDI-MS

1.4.3 MALDI-TOF的其他分析方法

1.4.4 中性丢失扫描

1.4.5 母离子扫描

1.5 磷酸化位点确定

1.6 蛋白质磷酸化的定量分析

1.7 本论文研究意义与主要内容

2 材料与方法

2.1 实验材料和仪器

2.1.1 实验试剂及材料

2.1.2 实验仪器及设备

2.1.3 材料的处理

2.1.4 缓冲溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 磷酸化肽的液相色谱-质谱联用条件

2.2.2 3-氨丙基固定相硅胶的合成

2的合成'>2.2.3 0.5G PAMAM-SiO₂的合成

2的合成'>2.2.4 1.0G PAMAM-SiO₂的合成

2对Ti⁴⁺的吸附性能的测定'>2.2.5 不同pH值条件下PAMAM-SiO₂对Ti⁴⁺的吸附性能的测定

2对Ti⁴⁺的吸附'>2.2.6 不同时间下PAMAM-SiO₂对Ti⁴⁺的吸附

2对Ti⁴⁺吸附测定'>2.2.7 不同温度下PAMAM-SiO₂对Ti⁴⁺吸附测定

2.2.8 蛋白溶液酶解

2.2.9 磷酸化肽富集和分离

2.3 数据库检索

3 结果与讨论

2材料的表征'>3.1 树枝状聚合物PAMAM-SiO₂材料的表征

3.2 材料的验证

2表面氨基含量测定'>3.2.1 PAMAM-SiO₂表面氨基含量测定

4+的吸附性能的影响'>3.2.2 pH值对Ti⁴⁺的吸附性能的影响

2对Ti⁴⁺的吸附'>3.2.3 不同温度下PAMAM-SiO₂对Ti⁴⁺的吸附

2对Ti⁴⁺的吸附'>3.2.4 不同时间下PAMAM-SiO₂对Ti⁴⁺的吸附

3.3 实验分析目标物的选择

4+-PAMAM-SiO₂树枝状聚合物材料的富集效果'>3.4 Ti⁴⁺-PAMAM-SiO₂树枝状聚合物材料的富集效果

3.5 富集条件的优化

3.5.1 乙腈对富集磷酸肽效果的影响

3.5.2 不同酸的种类对富集磷酸肽效果的影响

4+-树枝状聚合物富集磷酸肽的检测限'>3.5.3 Ti⁴⁺-树枝状聚合物富集磷酸肽的检测限

3.5.4 磷酸化肽段富集后材料清洗次数的影响

3.5.5 洗脱溶液的选择

4+-PAMAM-SiO₂树枝状聚合物材料富集磷酸肽的重现性'>3.5.6 Ti⁴⁺-PAMAM-SiO₂树枝状聚合物材料富集磷酸肽的重现性

4+-PAMAM-SiO₂树枝状聚合物材料富集磷酸肽的选择性'>3.5.7 Ti⁴⁺-PAMAM-SiO₂树枝状聚合物材料富集磷酸肽的选择性

3.6 液相色谱条件优化

3.6.1 流动相优化

3.6.2 梯度洗脱条件的确定

4+-PAMAM-SiO₂树状聚合物富集牛奶中的磷酸化肽'>3.6.3 Ti⁴⁺-PAMAM-SiO₂树状聚合物富集牛奶中的磷酸化肽

4 结论

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢

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