论文摘要
背景/意义动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的发生发展是一种多因素综合作用导致的慢性血管性疾病,单独的一种学说不能完全解释AS的病因及发病过程。炎症反应和凝血系统的激活在动脉粥样硬化发病过程中起着重要作用,炎症可导致凝血系统的激活,而凝血活动又可影响炎症的反应。组织因子（tissue factor,TF）作为一种天然的凝血系统启动子,在动脉粥样硬化的炎症反应和凝血级联反应中均扮演着重要角色。将TF作为靶点,有可能成为治疗AS引起的各种急性心血管性疾病的一个可靠靶点。本研究试图利用RNA干扰原理,以腺病毒为载体,将针对TF基因的外源性发夹环小干扰RNA片断导入腺病毒载体,通过体外重组技术构建稳定表达TF-shRNA的重组体腺病毒,并观察这种重组腺病毒感染白介素-18（interleukin-18,IL-18）刺激下,血管平滑肌细胞中TF产生的变化,以探讨RNA技术在治疗血栓性疾病的的应用前景,并为研究TF的多种生物学效应建立实验基础,为将TF作为基因治疗靶点提供实验依据,为治疗动脉粥样硬化引发的各种疾病开辟新途径。本实验主要分成以下3部分。方法和内容第一部分人组织因子干扰载体的构建和真核表达目的:1、筛选较高转染效率的转染试剂,并进一步优化该转染试剂在转染人TF小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）时的转染条件。2、构建携带TF基因的发夹环小干扰RNA（short hairpin RNA,shRNA）的质粒表达载体,观察重组质粒对TF基因的沉默效果。方法:1、分别利用含GFP绿色荧光蛋白的报告质粒pEGFP-N1和LipofectamineTM2000与LipofectamineTM-PLUS进行转染,荧光显微镜下观察各组细胞的转染效率;参照文献和RNA干扰靶序列设计原则,化学合成含有荧光的siRNA,并利用筛选具有较高转染效率的转染试剂,优化其转染人TF的siRNA时的转染条件。2、设计合成针对TF基因的小发夹环结构的RNA（shRNA）,克隆至含CMV启动子的穿梭质粒表达载体pShuttle-CMV-1.0,构建重组质粒,采用脂质体-LipofectamineTM 2000转染HEK-293细胞株,反转录半定量聚合酶链反应法（reverse transcriotase polymerasechain reaction,RT-PCR）检测携带TF-shRNA质粒表达载体抑制TF mRNA表达的效果。3、所有数据以均数±标准差（Means±S.D.）表示,多个样本均数比较采用析因设计的方差分析,多重比较采用Bonferroni法。结果:1、LipofectamineTM2000具有较高的转染效率,经过优化其转染siRNA的效率大于90%。2、成功构建了携带TF-shRNA的质粒表达载体pShuttle-CMV-TF-shRNA,酶切鉴定及测序证实插入的外源基因序列正确。3、RT-PCR方法检测重组质粒转染后,HEK-293细胞中TF mRNA的表达变化。转染对照组TF mRNA值为3.66±0.01,在转染含有TF shRNA重组质粒组后24h、48h和72h,TF mRNA表达水平为2.11±0.01、1.21±0.05和0.56±0.01,与对照组相比,TF mRNA水平显著降低,结果有统计学意义（F=59076.697,P=0.000）,提示了TF shRNA重组质粒组能明显降低TF基因表达水平。结论:1、经过优化转染条件,阳离子脂质体LipofectamineTM2000可以将化学合成的siRNA高效地转染293细胞。2、成功构建携带TF-shRNA的质粒表达载体,构建的重组质粒可明显下调TF基因mRNA的表达水平,RNA干扰效果明显。第二部分携带人组织因子的重组腺病毒载体的制备和构建目的:构建携带TF-shRNA的重组腺病毒表达载体。方法:连接线性化腺病毒骨架质粒（LacZ）和带有CMV启动子的穿梭载体质粒pShuttle-TF-shRNA,采用磷酸钙共沉淀法将两种质粒表达载体共转化HEK-293包装细胞,两种质粒在HEK-293细胞内进行同源重组以获得重组体腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化并检测病毒滴度,用构建的重组腺病毒感染Hela细胞,检测重组腺病毒的生物安全性。3、所有数据以均数±标准差（Means±S.D.）表示,多个样本均数比较采用析因设计的方差分析,多重比较采用Bonferroni法。结果:采用同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒载体,酶切鉴定后进行大量扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,检测病毒滴度为3×1010 pfu/ml。MOI值100的病毒液感染HeLa细胞后,各组细胞生长状态无显著性差异（P=0.329）。结论:成功构建了携带TF-shRNA的腺病毒表达载体Ad-TF-shRNA,载体稳定,易于纯化和扩增,病毒滴度高,并具有较高的生物安全性。第三部分人重组组织因子腺病毒的体外功能初步研究目的:在成功构建腺病毒表达载体Ad-TF-shRNA的基础上,进行体外实验研究,探讨在白介素-18（interleukin-IL-18,IL-18）作用下,腺病毒载体对人脐动脉血管平滑肌TF抗原、凝血活性、mRNA和蛋白表达的变化。方法:1、采用组织块培养法分离人脐动脉血管平滑肌细胞,α-actin免疫组织化学检查阳性鉴定为平滑肌细胞。采用第3-4代细胞用于本实验研究。2、采用直接感染法,用重组腺病毒感染血管平滑肌细胞（SMCs）,确定最佳MOI,采用MTT法检测重组腺病毒对血管平滑肌细胞生长状态的影响;一期凝血法、ELISA法检测在IL-18作用下,分别于感染后8、24、48和72h检测细胞TF抗原、凝血活性的变化,并应用RT-PCR及Western blot方法检测感染后血管平滑肌细胞内TF基因mRNA及蛋白表达水平的改变。3、所有数据以均数±标准差（Means±S.D.）表示,多个样本均数比较采用析因设计的方差分析,多重比较采用Bonferroni法。结果:1、相差显微镜检查传代后的血管平滑肌细胞呈“峰”、“谷”状生长;α-actin免疫组织化学检查符合平滑肌细胞特征,第3-4代用于本实验研究。2、当MOI为50时,平滑肌细胞的感染效率为80%以上,当MOI为100时,平滑肌细胞的感染效率几乎为90%,说明重组腺病毒体外转染效率高,且细胞生长状态良好。3、台盼兰法分别在感染后1、3、4和8d细胞计数,结果显示,与对照组相比,在Ad-TF-shRNA和Ad-GAPDH-shRNA感染细胞天数相同时,细胞计数无显著性差异;各组感染后细胞生长状态良好,随着感染天数的增多,细胞数增多,有显著性差异（P＜0.05）,采用时间点细胞数与对照组相比,无显著性变化（P＞0.05）。4、在100ng/mL的IL-18作用下,与对照组相比,平滑肌细胞8h、24h、48h和72h后上清液中TF抗原含量和凝血活性都有显著性升高（P=0.000）,含有TF特异片段的重组腺病毒Ad-TF-shRNA感染SMCs 8h后,与IL-18作用处理组相比,TF抗原含量和凝血活性均明显降低（P=0.000）。RT-PCR结果显示,在感染后24、48和72内,与对照组相比相比,Ad-TF-shRNA能显著降低细胞内TF表达水平（P=0.000）;Western-blot结果亦证实,我们构建的靶向TF的Ad-TF-shRNA感染平滑肌细胞后,细胞内TF蛋白明显下降,与RT-PCR结果一致。以上结果提示IL-18可诱导血管平滑肌产生大量的TF,并具有较高的凝血活性,构建的携带TF shRNA的重组腺病毒Ad-TF可降低血管平滑肌细胞中TF含量和凝血活性,并且这种抑制作用是在mRNA和蛋白水平的抑制。结论:1、重组腺病毒Ad-TF对体外培养的人脐动脉血管平滑肌生长状态无影响。2、IL-18可诱导血管平滑肌细胞产生并表达TF,这种诱导作用可以由腺病毒载体介导的RNA干扰TF基因表达后,明显抑制TF含量和凝血活性,且这种作用是在mRNA及蛋白水平的抑制。创新点1、本研究首次运用发夹环小干扰RNA对动脉粥样硬化发病过程中凝血途径和炎症反应的关键基因TF基因进行干扰,将RNA干扰技术引入动脉粥样硬化的基因治疗;2.本研究首次将RNA干扰技术与基因重组以及基因载体技术联合应用于动脉粥样硬化基因治疗。构建携带TF-shRNA的重组体腺病毒,利用复制缺陷型腺病毒载体具有的高效、稳定、低遗传毒性等特性,将TF-shRNA高效地转运至血管平滑肌细胞内,降低炎症因子IL-18作用下,血管平滑肌细胞中TF表达。