雄性小鼠睾丸支持细胞中Attractin的功能研究

论文摘要

第一部分Atrn基因功能缺失雄性小鼠生殖系统表型分析目的：观察Atrn基因功能缺失雄性小鼠生殖系统表型，为研究Atrn基因在雄性生殖系统中的作用提供实验依据。方法：以C3HeB／FeJ种系Atrn基因缺失小鼠(Atrnmg-3J)为实验组，同种系野生型小鼠为对照组，通过观察不同年龄段（3月龄和5月龄）Atrn基因缺失小鼠和对照组小鼠睾丸和附睾重量、形态学改变、附睾尾精子密度和活动率，并用分光光度法检测4组小鼠睾丸组织酶乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）水平，并通过与同种系野生型雌鼠交配进行交配试验和体外受精试验，评估Atrnmg-3J雄鼠的生育能力。结果：与相同月龄对照组小鼠相比，3月龄Atrn基因缺失小鼠SDH比活性降低（P＜0.05），其他指标无明显改变。5月龄Atrn基因缺失小鼠睾丸组织切片HE染色，精曲小管结构破坏；睾丸重量下降（P＜0.05）；附睾尾精子密度和活动率下降（P＜0.05），LDH活性和SDH比活性降低（P＜0.05）；雌鼠与5月龄Atrn基因缺失雄鼠交配后可观察到阴道栓，但每只雌鼠平均胎仔数减少（P＜0.05）；体外受精试验结果显示Atrn基因缺失小鼠附睾精子与正常卵子受精率下降（P＜0.05）。结论：研究结果显示随着月龄的增加，Atrn基因缺失使雄性小鼠生殖系统发生退行性改变，表现为睾丸精曲小管结构改变和精子功能受损，这可能是导致Atrn基因缺失雄性小鼠生殖力下降的主要原因之一。然而受孕是一个复杂的生理过程，涉及多个因素的影响，本研究为进一步深入探讨Atrn基因在雄性生殖系统的生理作用机制奠定研究方向和实验基础。第二部分干扰Atrn表达的小鼠睾丸支持细胞株的建立目的：通过基因转染和RNA干扰技术，使小鼠睾丸支持细胞中内源性Atrn表达受到抑制，进一步研究Atrn在睾丸支持细胞中的作用。方法：本实验采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光方法检测小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞中Atrn mRNA和蛋白的表达。针对Atrn的编码序列中3段siRNA靶序列设计相应DNA序列，将其插入H1启动子下游，克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中，转化DH5α菌株扩增，提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。将重组载体在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下瞬时转染TM4细胞，以转染试剂组（liposome）、阴性对照组（psiRNA-hH1）、空白对照组（未转染的TM4细胞）通过Q-PCR和Western blot法检测转染第3天Atrn mRNA、蛋白表达水平，确定有效序列，用含有该序列的重组载体稳定转染细胞，G418筛选，建立稳定干扰Atrn表达的睾丸支持细胞株，并用Q-PCR和ELISA分别对其分泌产物抑制素α（Inhα）mRNA和细胞培养液中的抑制素B（Inb B）的表达进行了检测，以探讨在细胞水平抑制内源性Atrn的表达对支持细胞功能的影响。结果：小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞表达Atrn mRNA和蛋白。构建重组载体psiAtrn-770、psiAtrn-2273、psiAtrn-2908，酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。将重组载体瞬时转染TM4细胞，转染后72h，以psiAtrn-2273和psiAtrn-2908转染组抑制Atrn mRNA和蛋白表达效果明显（P＜0.05）；psiAtrn-2273与psiAtrn-2908转染组之间相比，psiAtrn-2273转染组ATRN蛋白表达水平更低（P＜0.05）。转染试剂组，阴性对照组与空白对照组相比，Atrn mRNA和蛋白表达差异无统计学显著意义（P＞0.05）。质粒psiAtrn-2273能有效地阻断支持细胞内源性基因的表达，以质粒psiAtrn-2273稳定转染TM4细胞获得稳定干扰Atrn表达的TM4细胞株psiAtrn-TM4，以空质粒psiRNA-hH1稳定转染后得到的细胞株psiRNA-TM4为后续实验对照，psiAtrn-TM4细胞中Atrn mRNA表达抑制率约为80.1％，蛋白表达抑制率约为72.98％。当Atrn表达受到抑制的时候，InhαmRNA和细胞培养液中的Inb B与对照组细胞相比分别上升了约34.01％和17.9％，差异有统计学显著性意义（P＜0.05）。结论：本部分实验成功构建针对Atrn基因的特异性真核表达载体，建立了稳定干扰Atrn表达的TM4细胞株，有效地降低了支持细胞Atrn基因的表达。当内源性AtrnmRNA表达受到抑制时，小鼠睾丸支持细胞分泌产物抑制素表达水平升高。第三部分应用蛋白组学技术分离鉴定睾丸支持细胞中ATRN功能相关的蛋白质目的：通过蛋白组学技术分离鉴定小鼠睾丸支持细胞中Atrn基因部分缺失和完全缺失情况下差异性表达的蛋白质，为进一步研究Atrn在小鼠睾丸支持细胞中的功能提供科学依据。方法：酶消化法原代培养小鼠睾丸支持细胞，并通过Feulgen染色、Hoechst染色、吖啶橙染色鉴定细胞纯度。以空质粒psiRNA-hH1稳定转染后得到的细胞株（psiRNA-TM4）为实验对照，采用双向凝胶电泳技术分离（two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE）、基质辅助激光解析质谱（Matrix-assisted laserdesorption／icnization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）研究稳定干扰Atrn基因表达的小鼠睾丸支持细胞（psiAtrn-TM4），Atrn基因缺失小鼠原代睾丸支持细胞（mu-Sc）细胞中与Atrn缺失相关差异表达的蛋白质，并通过Q-PCR和Western Net对部分差异表达蛋白质mRNA和蛋白表达进行验证。结果：实验分离的培养Atrnmg-3J小鼠睾丸支持细胞，纯度达95％。采用2-DE与MALDI-TOF-MS联合分离鉴定psi-RNA-TM4，psi-Atrn-TM4，mu-Sc3组细胞中差异性表达的蛋白质，鉴定出主要的14个差异表达的蛋白质，其中有8种蛋白质包括ATPSYNTHASE，PEROXIREDOXIN 2，CU／ZN SUPEROXIDE DISMUTASE 1等在Atrn基因部分缺失细胞（psiAtrn-TM4）和完全缺失细胞（mu-Sc）中表达下调，6种蛋白质包括CASPASE6，KETOHEXOKINASE等上调，其中Sod1和caspase6 mRNA和蛋白在3组细胞中的的差异表达水平得到进一步验证。结论：Atrn基因缺失导致相关蛋白质的差异性表达提示Atrn基因对睾丸支持细胞功能的影响是通过多途径实现的，包括抗氧化应激以及调控凋亡途径。为进一步深入研究Atrn在小鼠睾丸支持细胞中的功能和Atrn缺失导致小鼠睾丸退行性变的具体作用机制提供重要了依据和线索。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 Atrn基因缺失雄性小鼠生殖系统表型分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 干扰Atrn基因表达的小鼠睾丸支持细胞株的建立
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 应用蛋白组学技术分离鉴定小鼠睾丸支持细胞中ATRN功能相关的蛋白质
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 总结
• 综述
• 英文缩略词一览表
• 附录
• 致谢