音猬因子、维甲酸等诱导体系上清液在成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的作用

论文摘要

目的:近年来大量的研究表明体外骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal cells ,BMSCs）可以诱导分化为神经细胞,因此BMSCs有望成为神经细胞移植的种子细胞来治疗神经系统疾病,但体外BMSCs向神经细胞分化的机制尚不清楚。随着对神经发育过程中体内产生的一些因子如:音猬因子（Sonic hedgehog,Shh）、维甲酸（Retinoic acids,Ra）等研究的不断深入,提示了其可能在骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化过程中起着重要的作用。故本课题采用Shh、Ra、福斯克林（Forskolin,Fn）联合诱导BMSCs后的上清液再诱导BMSCs,观察其向神经细胞分化的情况,来探讨该上清液的诱导分化作用及其产生促分化作用的机制。方法:取健康成年志愿者骨髓4ml,以全骨髓培养法分离成人骨髓间充质干细胞,以含20%胎牛血清的低糖型DMEM培养基进行原代培养和传代培养。用流式细胞仪检测BMSCs表面CD45、CD90、CD105的含量以鉴定纯度。以含有Shh、Ra、Fn的DMEM无血清培养基诱导第三代的BMSCs,分别在6h、12h、24h、3d、5d和7d时收集诱导后培养液上清。以不同时间点的上清液诱导第五代的BMSCs为实验组（依次为6h上清组、12h上清组、24h上清组、3d上清组、5d上清组、7d上清组）,设立阴性对照组:诱导液为DMEM无血清培养基、阳性对照组:诱导液为含有Shh、Ra、Fn的DMEM无血清培养基。观察细胞形态变化并计数,诱导7天后以免疫细胞化学法测定各组细胞神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶（Neural-specific enolase ,NSE）、神经元特异性烯醇化酶（Neural-specific enolase ,MAP-2）,以及神经胶质细胞特异性表面标志胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达,以鉴定是否诱导为神经元样细胞并计算分化百分率。各组间分化百分率进行比较和统计学处理。并用MTT法测定诱导后细胞生长状况。使用ELISA法检测诱导前培养体系上清（12h、24h、3d）和诱导前培养体系上清（12h、24h、3d）中NGF含量,观察其变化。结果:骨髓细胞接种2天后给予PBS冲洗,全量换液可见贴壁细胞呈集落状生长。810天后细胞可基本铺满瓶底,为均一梭状细胞。以1:3比例传代,传代后1天左右细胞可以恢复活力并贴壁生长,56天后可铺满瓶底。传代至45代时细胞形态比较均一,混杂细胞较少。流式细胞术检测细胞表面CD90、CD105阳性而CD45阴性证明了BMSCs的纯度。诱导1天后细胞形态发生变化,细胞收缩呈圆形并出现少量细胞突起。诱导3天后较多细胞出现单极或多极突起,有少量细胞突起相连呈网状。5天后有少量细胞悬浮死亡,突起延长多交织成网状;7天时细胞形态与5天时基本相同,但悬浮死亡细胞较多。阴性对照组细胞仍呈均一长梭状细胞,但细胞生长速度明显减慢。免疫细胞化学检测各实验组细胞均有NSE、MAP-2表达,但6h、12h、24h上清液诱导组NSE、MAP-2细胞阳性率均较3d、5d和7d组高（P<0.05）,3d、5d和7d各组细胞阳性率差异不显著（P>0.05）。阳性对照组、12h上清组细胞分化率大于6h上清组和24h上清组（P<0.05）;阳性对照组、12h上清组细胞分化率无显著差异（P>0.05）、6h上清组和24h上清组分化率无显著差异（P>0.05）。12h上清组诱导后细胞生存状态优于阳性对照组（P<0.05）。诱导后上清液各时间点（12h、24h、3d）NGF浓度均明显高于诱导前上清组（12h、24h、3d）（P<0.01）。结论1、使用全骨髓培养法可以有效的从骨髓中分离BMSCs,并在体外扩增。传代培养至第4-6代时可获得纯度较高的BMSCs。2、Shh、Ra、Fn联合作用BMSCs后的上清液具有诱导BMSCs向神经细胞分化的作用,其中以12h上清液促进分化作用最为明显。3、Shh、Ra、Fn三者联合作用于BMSCs可促进其分泌NGF到细胞外。4、Shh、Ra、Fn三者在联合作用于BMSCs向神经细胞分化的过程中可能有重要的新物质/中间物质的产生。新物质/中间物质可能具有推动分化或者维持分化进行的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 插图和附表清单
• 英文缩略语（ABBREVIATION）
• 前言
• 第一章 成人 BMSCS 的分离培养、传代培养及鉴定
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 第二章 成人BMSCS 的定向诱导分化和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 上清液中神经生长因子检测
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 个人简历
• 致谢