血瘀证模型的相关蛋白质组学研究

论文摘要

本课题在前期建立稳定的气滞和气虚血瘀证大鼠、痰瘀互结证冠心病小型猪模型基础上,应用双向凝胶电泳（2-DE）、基质辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等先进的蛋白质组学技术方法,对正常和气滞血瘀、气虚血瘀及痰瘀互结证冠心病三种不同血瘀证模型动物的血清、心脏血管和心肌组织分别进行蛋白提取、分离及鉴定,利用比较蛋白组学研究方法,寻找与血瘀证形成相关的特异表达蛋白质,以期获得潜在的血瘀证的诊断标记和治疗靶标,进一步揭示血瘀证发生、发展过程中的分子生物学基础。第一部分气滞血瘀证模型大鼠血清蛋白质组学初步研究正常组、气滞血瘀证模型组大鼠各10只,将每组大鼠的血清混合,去除血清白蛋白。应用pH4—7,长24cm的IPG胶条进行等电聚焦电泳,为保证重复性,每组分别进行3次双向电泳。利用Image Master 2D Elite 6.01分析软件对正常组和模型组大鼠的血清蛋白质表达谱进行差异比较。实验结果显示:在相同条件下,模型组和正常组平均检测出347±37、354±20个蛋白点;选择好参照胶后,将其他凝胶与参照胶相匹配,平均匹配上的蛋白点数为280±23,匹配率为75.3%;找出蛋白体积百分比值（%Vol）差异大于两倍以上的蛋白点,发现气滞血瘀证大鼠血清与正常组相比共有7个差异蛋白点,其中1个蛋白质下调,5个蛋白质上调,1个蛋白表达缺失。从制备胶中挖取这些差异蛋白点进行胶内酶解,酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析,所得m/z数据送入NCBI非冗余数据库,通过MASCOT搜索引擎检索,检索分值在71分以上视为可信结果。检索出Isovaleryl-Coa Dehydrogenase、STAT3-interacting protein2个蛋白,其中Isovaleryl-Coa Dehydrogenase下调,STAT3-interacting protein上调。STAT3-interacting protein与细胞因子的信号转导通路密切相关,它们在气滞血瘀证的形成中所起的作用有待于进一步研究。第二部分气虚血瘀证模型大鼠血清蛋白质组学初步研究正常大鼠和气虚血瘀证大鼠各10只,利用2-DE图谱分析软件对正常组和模型组的血清蛋白表达谱进行差异分析,实验结果表明:气虚血瘀证模型组平均检测出413±13个蛋白点,而正常组平均检测出401±37个蛋白点;与参照胶相匹配,平均匹配上的蛋白点数为368±12,匹配率为88.5%:选出蛋白%Vol值差异大于2倍以上的蛋白点,发现气虚血瘀证大鼠血清与正常组相比共有7个差异蛋白点,其中1个蛋白质下调,5个蛋白质上调,1个蛋白表达缺失。经质谱分析及MASCOT检索,鉴定出CD5 antigen-like、haptogiobin、complementcomponent C3等6个蛋白,其中1个蛋白下调,5个蛋白上调,这些蛋白的功能与炎症反应、免疫调控等病理过程相关,与已知的气虚血瘀证的发生、发展过程基本相符。第三部分小型猪痰瘀互结证冠心病的蛋白质组学研究正常组和模型组小型猪各6只,通过高脂饲料喂养结合球囊拉伤在小型猪体内建立冠心病痰瘀互结模型。血清、冠状动脉和心肌组织总蛋白均进行双向电泳分离,每种样品分别进行3次双向电泳以保证重复性。利用Image Master 2D Elite 6.01分析软件对正常组和模型组的蛋白质表达谱进行差异分析。在相同分析条件下,3组样品实验结果分别如下:1、血清样品2-DE图中,模型组和正常组分别平均检测出394±23、440±25个蛋白点:与参照胶平均匹配上的蛋白点数为363±25,平均匹配率为82.8%;痰瘀互结证冠心病小型猪血清与正常组相比共有17个差异蛋白点,6个上调点,1个下调点,7个缺失点,3个特异表达的点。2、冠状动脉样品2-DE图中,模型组平均检测出1098±37个蛋白点,而正常组平均检测出967±44个蛋白点;与参照胶平均匹配上的蛋白点数为895±45,平均匹配率为86%。痰瘀互结证冠心病小型猪冠状动脉与正常组相比共有蛋白差异点35个,14个上调点,17个特异表达点,另外模型组中有4个点发生未知修饰变化。3、心肌组织样品2-DE图中,模型组、正常组平均检测出978±32和890±38个蛋白点:平均匹配上的蛋白点数为725±43,匹配率为76.7%;痰瘀互结证冠心病小型猪心肌组织与正常组相比共有14个差异蛋白点,13个上调点,1个特异表达点。经质谱分析及MASCOT检索,血清样品鉴定出complement component 4 bindingprotein、apolipoprotein E precursor等3个蛋白;冠状动脉组织鉴定出transgelin、coactosin-like 1等17个蛋白;心肌组织鉴定出HSPA8 protein、apolipoprotein A-Ⅳ等9个蛋白。以上鉴定出来的蛋白有半数是Albumin,部分蛋白质与炎症反应、血管重构、脂质代谢等病理过程相关,推测这些蛋白可能与痰瘀互结证冠心病的发生、发展相关。结论1、气滞血瘀证和气虚血瘀证大鼠的血清与正常健康大鼠相比,蛋白表达谱存在明显的差异,表明多种差异蛋白参与上述两种证候的发生发展。气滞血瘀证和气虚血瘀证大鼠血清分别鉴定出与这两种证候的实质相关的2个和6个差异蛋白,分别是STAT3-interacting protein、haptoglobin、ZN-alpha-2-glycoprotein等,这些蛋白的功能与炎症反应、免疫调控等病理过程相关。2、与正常健康小型猪相应组织比较,痰瘀互结证冠心病小型猪的血清、冠状动脉和心肌组织的蛋白表达谱均有明显差异,3种不同样品共鉴定出的30个差异表达蛋白质,分别是complement component 4 binding protein、transgelin、coactosin-like 1、HSPA8protein、apolipoprotein A-Ⅳ等,其参与了痰瘀互结证冠心病炎症反应、血管重构、脂质代谢等病理过程。3、上述不同证候模型蛋白质组学的鉴定结果,一方面佐证了这些动物模型基本符合临床疾病的发病特点;一方面表明部分鉴定出的差异蛋白确实与以上三种血瘀证的形成有着密切的关系。部分蛋白有望做为临床上潜在的、有应用价值的分子标志物,用于气滞血瘀证、气虚血瘀证及痰瘀互结证冠心病的诊断和预测。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 综述
• 综述一 蛋白质组学主要技术的研究进展
• 参考文献
• 综述二 血瘀证与分子生物学
• 参考文献
• 前言
• 总体技术路线图
• 第一部分 气滞血瘀证模型大鼠血清蛋白质组学初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 气虚血瘀证模型大鼠血清蛋白质组学初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 实验型小型猪痰瘀互结证冠心病蛋白质组学研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结语
• 致谢
• 个人简历