论文摘要
苯丙烷及其分支途径产生大量具有生物重要性的次生代谢物质。其中一条分支途径合成木质素，对于高等植物的机械支撑、维管传导以及抗病性具有重要作用，另一条分支途径合成各种类黄酮物质，它们除吸引传粉昆虫和保护植物不受紫外线伤害外，对人还具有抗炎、抗过敏和防癌的功效。苯丙烷途径还合成香豆素、水杨酸、异黄酮（植保素）、绿原酸以及芪等物质，作为植物的信号分子或拮抗物质。因此，对苯丙烷代谢途径的操作一直是一个研究热点。肉桂酸-4-羟化酶（C4H，EC 1.14.13.11）催化反式肉桂酸的羟化反应形成4-羟基肉桂酸，是公共苯丙烷途径的第2个关键酶，属于细胞色素单加氧酶超家族中的CYP73A亚家族。苯丙烷途径的核心关键酶形成一个复合物，C4H在位于胞质中的苯丙烷途径与位于膜上的电子传递反应之间起重要作用。甘蓝型油菜（Brassica napus）、白菜（B．rapa）和甘蓝（B．oleracea）是重要的世界性的油料作物或园艺作物，在它们中间有许多与苯丙烷途径相关的农艺性状是研究人员长期以来致力于遗传改良的焦点。比如，经常发生的倒伏问题要求更加强壮的茎和分枝，抗病性的提高要求更快和更高水平的受病原菌入侵而诱导的细胞壁木质化，而对木质素途径的流和强度以及不同木质素成份比例的遗传改良是解决该问题的一个重要保障。近年来油菜尤其是甘蓝型油菜的黄籽性状由于其优质特性而吸引了越来越多的研究人员，但是黄籽基因型的缺乏以及黄籽材料表现型的不稳定大大阻碍了黄籽油菜的育种与应用，黄籽性状的形成的分子机制不清楚。黄籽性状的最典型特征是种皮木质素和种皮色素的减少，业已证明种皮色素是原花青素的聚合物，原花青素是类黄酮途径的代谢产物，研究芸薹属C4H因有利于阐明黄籽性状的分子机理，也将会为通过转基因技术创造稳定的黄籽甘蓝型油菜打基础。在十字花科，除了已经克隆的拟南芥（Arabidopsis thaliana）C4H基因（AtC4H）外，并无其它的全长C4H基因被克隆，尽管该科中有许多重要的园艺和油料作物。本文报道了双二倍体物种甘蓝型油菜及其二倍体亲本物种甘蓝和白菜中C4H基因家族的克隆、分子分析和比较基因组学研究。用甘蓝型油菜典型黑籽自交系5B为材料，克隆了甘蓝型油菜C4H基因家族的18个成员的全长cDNA序列、大多数成员的基因组序列以及1个成员的保守区序列，分别命名为BnC4H-1～BnC4H-19。BnC4H-1基因为2192bp，5’非编码区（UTR）和3’UTR分别为93bp和131bp，两个内含子分别为71bp（879～949）和379bp（1084～1462），开放阅读框（ORF）为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，蛋白分子量（Mw）=57.73KDa，等电点（pI）=9.11。BnC4H-2基因为2108bp，5’UTR和3’UTR分别为95bp和103bp。两个内含子分别为85bp（881-945）和327bp（1080-1406），ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.74KDa，pI=9.13。BnC4H-3 mRNA为1831bp，5’UTR和3’UTR分别为183bp和130bp，ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.83KDa，pI=9.04。BnC4H-4基因为2110bp，5’UTR和3’UTR分别为11bp和190bp，两个内含子分别为71bp（797-869）和320bp（1002-1321），ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.76KDa，pI=9.21。BnC4H-5基因为2430bp，5’UTR和3’UTR的分别为124bp和145bp，两个内含子分别为75bp（910-984）和640bp（1113-1752），编码区3’区缺失一个碱基导致移码，ORF为1446bp，编码非标准的481个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=55.38 KDa，pI=9.06。BnC4H-6基因为2557bp，5’UTR和3’UTR分别为45bp和163bp，两个内含子分别为90（831-920）和741bp（1055-1795），ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.60KDa，pI=9.16。BnC4H-7 mRNA为1686bp，5’UTR和3’UTR分别为8bp和1414bp，编码区内终止突变，ORF为264bp，编码87个氨基酸的非标准的C4H蛋白，Mw=9.61KDa，pI=9.87。BnC4H-8 mRNA为1588bp，5’UTR和3’UTR分别为57bp和13bp，ORF长度为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.78KDa，pI=9.19。BnC4H-9 mRNA为1659bp，5’UTR和3’UTR分别为11bp和130bp，ORF长度为1518bp，编码标准的505个氨基酸的残基C4H蛋白，Mw=57.86KDa，pI=8.90。BnC4H-10 mRNA为1594bp，5’UTR和3’UTR分别为65bp和11bp，ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.74KDa，pI=9.21。BnC4H-11为538bp的保守区片断。BnC4H-12 mRNA为1706bp，5’UTR和3’UTR分别为124bp和394bp，编码区内终止突变，ORF为1197bp，编码398个氨基酸的非标准型的C4H蛋白，Mw=45.47KDa，pI=9.16。BnC4H-13基因为1957bp，5’UTR和3’UTR的分别为60bp和11bp，两个内含子分别为83bp（846-928bp）和285bp（1063-1347bp），ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.70KDa，pI=9.20。BnC4H-14 mRNA为1589bp，5’UTR和3’UTR分别为60bp和11bp，ORP长度为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.60KDa，pI=9.20。BnC4H-15 mRNA为1704bp，5’UTR和3’UTR分别为65bp和121bp，ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸的C4H蛋白，Mw=57.73KDa，pI=8.95。BnC4H-16 mRNA为1722bp，5’UTR和3’UTR分别为45bp和159bp，ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸的CAH蛋白，Mw=57.45KDa，pI=9.11。BnC4H-17mRNA为1737bp，5’UTR和3’UTR的分别为65bp和988bp，编码区内正向串联重复导致终止突变，ORF为684bp，编码非标准的227个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=26.22KDa，pI=9.79。BnC4H-18 mRNA为1594bp，5’UTR和3’UTR分别为65bp和323bp，编码区内终止突变，ORF为1206bp，编码非标准的401个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=45.92KDa，pI=9.23。BnC4H-19 mRNA为1723bp，5’UTR和3’UTR的分别为45bp和160bp，ORF为1518bp，编码标准的505个氨基酸残基的C4H蛋白，Mw=57.67KDa，pI=8.93。BnC4H基因家族的19个成员中不少成员表现出了影响蛋白编码特征的编码区突变，BnC4H-5、BnC4H-7、BnC4H-12、BnC4H-17以及BnC4H-18等五个成员由于点突变、缺失、插入正向重复序列等原因而使其不能编码标准的C4H蛋白。例如BnC4H-17在745-887bp处正向重复了602-744bp区间的143bp的碱基序列，从而造成编码区内的终止突变。BnC4H-5在2240bp后缺失了一个碱基C，造成这在编码区后部的终止突变。BnC4H-12 mRNA在其1525bp之后发生了和BnC4H-5一样的单碱基C缺失，同时该基因在该位点之前的1321bp处发生了G变A的终止突变，因此其终止突变比BnC4H-5更提前，导致所编码的蛋白在C末端缺失得更多。BnC4H7发生终止突变最早，由于其在第270bp处发生了A变T的突变，导致其终止密码大大提前，其ORF只编码一个87个氨基酸残基的多肽。BnC4H18 mRNA的终止突变发生在1270bp处的G变A，导致其ORF只编码401个氨基酸残基的多肽。除了六个突变基因不能编码标准的C4H蛋白和一个保守区片断无法预测其准确的ORF外，BnC4H基因家族其它12位成员都能编码标准的C4H蛋白。而且这些蛋白质都具有C4H蛋白的典型特征。如P450保守域和CypX保守域，酶活性位点氨基酸残基I109、K113、V118、F220、E301、N302、I303、V305、A306、T310、R366、R368、A370、I371、P372、L374、V375、P376、H377、K484、F488以及L490等，血红素结合基序PFGVGRRSCPG，含T结合基序A306AIETT311，5个底物结合位点SRSs。此外，这些蛋白质有一个信号肽、2个跨膜区、22-24个潜在的磷酸化位点、1-3个潜在的N-糖基化位点、4-6个潜在的氨基化位点、5-8个潜在的豆蔻酰化位点，二级结构和三级结构等预测的生物学信息方面都比较接近。例外的是BnC4H-3和BnC4H-4除了共同的磷酸化位点外，还各有一个依赖cAMP-cGMP的蛋白激酶磷酸化位点R248～R251。BnC4H-5、BnC4H-7、BnC4H-12、BnC4H-17以及BnC4H-18等5个成员在这些方面则有较大差异，主要是它们均或多或少的缺少了蛋白C端的一段肽链。以羽衣甘蓝黑籽自交系为材料克隆了甘蓝C4H家族（BoC4H）的3个成员的全长cDNA序列和相应的基因组序列。用白菜型油菜黑籽自交系为材料克隆了白菜C4H基因家族（BrC4H）的3个成员的全长cDNA和对应的基因组序列。BoC4H-1与甘蓝型油菜BnC4H-5完全一样，为同样的单碱基缺失突变，其余BoC4H和BrC4H基因都能编码标准的C4H蛋白。它们的基本特性和预测的P450保守域和CPYx保守域、酶活性位点、血红素结合基序、底物结合位点等生物信息都与甘蓝型油菜非常接近。BnC4H、BoC4H、BrC4H基因家族各成员间有较高的同源性，与AtC4H也有较高的同源性。在进化系统树中，拟南芥的C4H蛋白位于甘蓝型油菜C4H蛋白家族成员之间，把甘蓝型油菜的C4H蛋白家族的成员分成两个大组。拟南芥的C4H蛋白首先与甘蓝型油菜C4H家族的成员BnC4H-6、BnC4H-7、BnC4H-16、BnCAH-19等紧密聚在一起，形成一个分支，然后再与甘蓝型油菜C4H家族的其他成员聚类。从系统发生来看，BnC4H-5、BnC4H-7、BnC4H-12、BnC4H-16、BnC4H-19、BnC4H-6、BoC4H-1、BoC4H-2、BoC4H-3构成一个大类，而且这一大类与AtC4H较远，而与其它芸薹属C4H基因的距离更远一些。BnC4H-5和BoC4H-1之间的在2.4kb的全长序列上几乎完全一致，只是在位于内含子中1608bp处的oligoT处的T的数量上相差一个碱基，而且它们产生终止突变的位置和方式也完全一样。很多BoC4H和BrC4H基因成员与有关BnC4H成员间的序列相似性极强，远远高于种内不同成员间的相似性。序列多重比对可以广泛地发现，许多基因成员间是片段共享的，实际上一些成员就是其它成员各自提供的一些片段的串联物，这只能解释为同源基因的等位位点间或非等位位点间的片段交换，该结果从基因家族成员序列的角度直接证明了异花授粉的甘蓝型油菜等芸薹属植物基因组水平上存在非常活跃的等位和非等位同源基因间的交换。三个物种C4H基因家族的Southern杂交结果，甘蓝型油菜、甘蓝和白菜分别最多显示了9条、4条和5条杂交条带，进一步证明了这3个物种中C4H受多基因编码，而且甘蓝型油菜中C4H基因的拷贝数正好等于甘蓝和白菜型油菜之和。采用5B的根、茎、下胚轴、子叶、真叶、花、花蕾、花后10天种子、花后20天种子、花后30天种子以及荚果皮等11个器官组织的总RNA为材料，选择了BnC4H基因家族中系统发生学上具有代表性的成员BnC4H-1、BnC4H-2、BnC4H-6、BnC4H-10和BnC4H-13五个成员的特异引物进行半定量RT-PCR检测。BnC4H-1在花里的表达最强，其次是荚果皮，在20天种子里的表达最弱，在根、下胚轴、茎、子叶、真叶等其它器官的转录水平无明显差异。BnC4H-2在花里的表达最强，其次是蕾，在下胚轴和真叶以及10天和20天的种子中也有较强的表达，在子叶中表达较弱，在荚果皮中表达最弱，在根里则不表达。BnC4H-6除了在30天种子中表达相对弱一些外，在其余器官里都有较强的表达。BnC4H-10在花里的表达最强，其次是蕾，在根里的表达也较强，在开花后20天和30天种子中的表达比在根里的表达稍弱一些，在下胚轴，茎、真叶、开花后10天的种子以及荚果皮等其余组织中的表达更弱一些。BnC4H-13则在下胚轴、茎、花10天种子以及荚果皮等组织和器官中都有较强的表达，在子叶、真叶和开花后20天以及30天的种子中的表达较弱。用甘蓝型油菜黄、黑籽近等基因系主要生殖器官对BnC4H-1、BnC4H-2、BnC4H-6和BnC4H-10所做的半定量RT-PCR结果显示，黄籽系L2种子发育的主要阶段尤其是开花30天以后上述基因成员的转录表达明显低于黑籽系L1。综合上述结果，从中可以得出如下主要结论和创新点：1、通过基因家族成员克隆和Southern杂交表明，甘蓝型油菜和其亲本物种甘蓝及白菜中肉桂酸-4-羟化酶（C4H）均由多基因家族编码。2、十字花科祖先种中的C4H是多基因起源的，拟南芥的单拷贝C4H现象是由于其在进化过程中发生了基因家族成员丢失而造成的。拟南芥中现在保留的C4H基因与BnC4H-1等成员相对应，而与BnC4H-5等成员相对应成员则在拟南芥进化过程的中丢失了。3、导致芸薹属物种中C4H多基因家族编码的根本原因是继承了十字花科的C4H多基因起源的同时，发生了与拟南芥相比的基因组“三重化”加倍。BnC4H家族下的不同类群很可能代表了十字花科的C4H多基因起源，而每一个类群内部的高度同源基因成员则是芸薹属基因组“三重化”时候才通过基因加倍而产生的。本研究从基因家族克隆的角度直接肯定了芸薹属与拟南芥相比在基因组水平发生的“三重化”加倍的真实性。4、C4H基因家族的序列比对和Southern杂交结果比较还表明甘蓝和白菜的确是甘蓝型油菜的二倍体亲本物种，至少它们为甘蓝型油菜直接提供了遗传物质。在形成双二倍体后，一些基因成员在甘蓝型油菜中未有发生序列上的明显变化，因此与亲本物种甘蓝或白菜中的对应基因具有明显的对应关系（如BnC4H-5和BoC4H-1之间），而其它一些成员可能是因为片段交换、碱基变异等而与亲本物种中的相应基因的对应性有所降低。5、芸薹属物种的C4H多基因家族的一些成员上发生了明显的快速变异和序列进化／退化，如等位和非等位基因间的交换、终止突变、基因内部的正向重复等，由此引起所编码蛋白的快速歧化。6、芸薹属C4H多基因家族进化的另一重要表现是，成员间在转录表达水平的器官组织特异性方面发生了一定的分化、分工和互补。7、甘蓝型油菜黄籽材料的种子发育的主要时期与黑籽材料相比，C4H基因主要成员均表现了转录水平的表达下调，证明种皮中C4H表达的抑制的确是油菜黄籽性状形成的一个重要原因，但其源头应该发生在调控C4H表达的上游信号基因上或种皮发育相关的基因上的突变。本研究为进一步研究C4H基因在决定有关性状中的作用、阐明C4H的分子机理和进化以及通过调控C4H基因表达水平来操作C4H相关的重要性状打下了基础。
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