一、MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复（论文文献综述）
许琳[1]（2021）在《基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制》文中指出研究背景溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种慢性、复发性疾病,是炎症性肠病的常见亚型之一。UC以反复发作的腹泻、腹痛,黏液脓血便为主要临床特点,近10年来我国UC发病率迅速上升。UC的发病机制复杂,其中肠黏膜屏障损伤是UC发病的重要病理生理基础,黏膜愈合是UC治疗的关键终点指标,但维持肠黏膜屏障完整,促进肠上皮损伤后修复的调控机制尚未阐明。巨噬细胞作为固有免疫系统中的主要效应细胞,在UC炎症损伤和上皮修复过程中发挥关键作用。巨噬细胞失调是UC黏膜免疫紊乱的突出特征,同时是达到黏膜愈合和体内稳态的关键靶点。目前UC的治疗方案仍存在停药后难以长期维持临床缓解及部分患者无应答的问题,严重影响了患者的生活质量并导致了高昂的医疗负担。鉴于巨噬细胞强大的可塑性及其在肠道稳态中的调控作用,近年来巨噬细胞成为UC治疗的焦点。最近的研究表明β-catenin/FOSL2/ARID5A或为调控巨噬细胞极化的关键通路,但其在UC发生发展中的作用尚需进一步明确。越来越多的研究证据支持中医药治疗UC具有良好的临床效果,能有效缓解患者临床症状,改善预后,但具体的作用机制尚需进一步明确。清热利湿复方加味葛根芩连汤是导师唐旭东教授在对UC基本病机理解的基础上,结合多年临床经验制定的经验方。前期动物实验结果表明加味葛根芩连汤能够减轻葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠结肠炎症状,改善结肠黏膜超微结构,但其作用机制尚待进一步阐明。由此,我们思考加味葛根芩连汤改善UC症状,减轻肠黏膜损伤的机制是什么,是否与调控肠巨噬细胞极化有关,其调控巨噬细胞极化、促进肠上皮修复的通路和靶点是什么,是否与β-catenin/FOSL2/ARID5A通路相关,这值得我们进一步探讨。第一部分UC患者巨噬细胞极化状态的临床研究研究目的明确UC患者结肠巨噬细胞极化状态及β-catenin/FOSL2/ARID5A蛋白表达情况。研究方法1 采用多因子检测方法,对UC患者及健康受试者血清中炎症因子（IP-10、IL-12p70、TNF-α、IL-1β、IL-12p40、IL-23、IL-6、IL-4、IL-10、Arginase、TARC、IL-1RA）含量进行检测。2采用免疫组化检测UC患者及健康受试者结肠活检组织的巨噬细胞极化相关蛋白FOSL2、ARID5A的表达情况。3采用免疫荧光检测UC患者及健康受试者肠黏膜巨噬细胞极化相关蛋白CD68、CD163、iNOS,肠黏膜屏障关键蛋白 ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin的表达情况。研究结果1与健康受试者相比,UC患者促炎因子IP-10表达水平显着升高（p<0.01）,抑炎因子 IL-10（p<0.05）、IL-4（p<0.05）、Arginase（p<0.001）、IL-1RA（p<0.01）表达水平显着降低。2与健康受试者相比,UC患者结肠组织中肠黏膜屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin 表达水平显着降低（p<0.05）。3与健康受试者相比,UC患者结肠组织中M1巨噬细胞标志蛋白iNOS表达水平显着上升（p<0.05）,M2标志蛋白CD163表达水平显着下降（p<0.05）。与健康对照组相比,UC患者结肠组织中巨噬细胞极化相关蛋白FOSL2表达水平显着下降（p<0.05）,ARID5A表达水平显着上升（p<0.05）。研究结论一1 UC患者存在炎症因子失衡,具体表现为促炎因子IP-10上调,抑炎因子IL-10、IL-4、Arginase、IL-1RA 下调。2 UC患者存在肠黏膜屏障损伤,肠黏膜屏障关键蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin表达水平降低。3 UC患者存在巨噬细胞极化异常及巨噬细胞极化相关通路β-catenin/FOSL2/ARID5A表达异常,表现为M1巨噬细胞增多,M2巨噬细胞减少,β-catenin、FOSL2表达水平下降,ARID5A表达水平上升。4 β-catenin/FOSL2/ARID5A信号通路的异常可能导致了巨噬细胞极化失调,继而导致炎症因子失衡及肠黏膜屏障的损伤。第二部分加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的效应机制研究在体实验加味葛根芩连汤对DSS诱导结肠炎巨噬细胞极化的影响研究目的明确加味葛根芩连汤干预DSS诱导急性结肠炎模型小鼠的疗效,以巨噬细胞极化为切入点,阐明加味葛根芩连汤发挥疗效的作用机制。研究方法1以DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型为载体,将小鼠随机分为正常组、模型组、加味葛根芩连汤低剂量组、加味葛根芩连汤中剂量组、加味葛根芩连汤高剂量组,以小鼠体重,疾病活动指数,脾重,结肠长度,结肠组织病理学评分,电镜为指标评估加味葛根芩连汤的干预效果。2观察加味葛根芩连汤对肠黏膜屏障的影响:检测小鼠肠黏膜通透性,结肠组织髓化过氧化物酶含量,丙二醛含量,采用免疫组化检测结肠BrdU表达水平评估上皮增殖状况;采用免疫组化检测结肠E-Cadherin,β-catenin,Occludin,ZO-1表达,评估肠黏膜屏障损伤情况。3观察加味葛根芩连汤对巨噬细胞极化的影响:采用流式细胞术检测小鼠脾脏及结肠组织中M1/M2巨噬细胞亚型的含量;采用免疫荧光检测小鼠结肠组织F4/80、CD206 含量;采用 Elisa 检测结肠组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量。4基于β-catenin/FOSL2/ARID5A信号通路,研究加味葛根芩连汤调控巨噬细胞极化的分子机制:采用Western blot检测结肠组织β-catenin、FOSL2、ARID5A 蛋白水平表达情况,采用 Realtime PCR 检测 β-catenin、FOSL2、ARID5A mRNA水平表达情况。研究结果1小鼠一般情况:与正常组相比,模型组小鼠出现弓背、毛发竖起,活动减少,体重降低,腹泻,便血的状况,结肠长度明显缩短,脾重明显增加,组织病理学评分明显升高。与模型组相比,加味葛根芩连汤各给药组小鼠体重显着上升（p<0.001）,加味葛根芩连汤高剂量组DAI评分显着降低（p<0.001）,各给药组结肠缩短状况明显改善（p<0.05）,脾重明显降低（p<0.05）,各给药组组织病理学评分均降低（p<0.05）。结肠电镜结果显示:正常组小鼠的微绒毛发达。细胞充满了线粒体和囊泡。可在细胞与细胞接触的腔侧见到细胞间连接复合体。与正常组相比,模型组小鼠的结肠中,多数紧密连接的结构紊乱,融合点较少见,并且细胞间间隙增宽。加味葛根芩连汤干预组介于正常组与模型组之间。2肠黏膜屏障评估:与正常组相比,模型组肠黏膜通透性明显升高（p<0.05）,MPO含量明显升高（p<0.05）,MDA含量明显升高（p<0.05）,BrdU表达降低（p<0.05）;与模型组相比,各给药组肠黏膜通透性均降低（p<0.05）,各给药组MPO含量显着降低（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组MDA含量显着降低（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组BrdU表达显着上升（p<0.05）。免疫组化检测结果显示,与正常组相比,模型组E-Cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1表达量下降（p<0.05）,与模型组相比,加味葛根芩连汤中剂量组E-Cadherin、Occludin表达上升（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、高剂量组β-catenin表达上升（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组、高剂量组ZO-1表达均显着上升（p<0.05）。4结肠炎症因子检测结果显示与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠黏膜组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高（p>0.05）,IL-10含量降低（p>0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤各剂量组IL-1β、IL-6含量降低（p<0.05）;。5流式细胞术检测结果:脾脏流式结果显示,与正常组相比,模型组脾脏中M2巨噬细胞比例下调（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤高剂量组白细胞比例下调（p<0.05）,低剂量和中剂量组DC细胞比例下调（p<0.05）,低剂量组M2比例上调（p<0.05）。结肠流式结果显示,与正常组相比,模型组结肠组织中巨噬细胞比例上调（p<0.05）,M1巨噬细胞比例显着上调（p<0.05）,M2巨噬细胞比例下调（p>0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤中剂量和高剂量组Ml比例下调（p<0.05）,高剂量组M2比例上调（p<0.05）,高剂量组DC细胞比例下调（p<0.05）。免疫荧光结果显示与正常组相比,模型组F4/80表达量显着上升（p<0.05）。6β-catenin/FOSL2/ARID5A表达情况:Western blot检测结果显示:与正常组相比,模型组β-catenin表达降低（p>0.05）,FOSL2表达显着降低（p<0.05）,ARID5A表达升高（p<0.05）。与模型组相比,加味葛根芩连汤各组β-catenin表达均显着升高（p<0.05）,加味葛根芩连汤各组FOSL2表达均显着升高（p<0.05）;加味葛根芩连汤中剂量组、高剂量组ARID5A表达降低（p<0.05）。Real Time PCR检测结果显示,与正常组相比,模型组小鼠结肠组织中β-catenin mRNA、FOSL2mRNA表达水平明显降低（p<0.05）,ARID5AmRNA表达水平明显升高（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤低剂量组β-cateninmRNA、FOSL2 mRNA水平明显升高（p<0.05）,与模型组相比,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组、高剂量组ARID5A mRNA表达水平显着升高（p<0.05）。研究结论二1加味葛根芩连汤可有效减轻DSS诱导的结肠炎症状,改善体重减轻,结肠缩短,下调MPO、MDA水平,改善肠黏膜超微结构,降低DSS导致的结肠黏膜通透性增加,下调结肠组织促炎因子IL-1β、IL-6表达水平,促进肠上皮增殖,诱导E-Cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1表达上调,维持肠黏膜屏障完整。2加味葛根芩连汤可调控结肠炎小鼠巨噬细胞极化状态,抑制M1巨噬细胞极化,促进M2巨噬细胞极化,上调β-catenin、FOSL2表达,下调ARID5A表达。离体实验加味葛根芩连汤含药血清对THP-1巨噬细胞极化的影响研究目的明确加味葛根芩连汤体外干预M1巨噬细胞极化模型的作用,阐明加味葛根芩连汤发挥疗效的作用靶点。研究方法1构建M1巨噬细胞极化模型:采用PMA叠加LPS/IFN-γ刺激THP-1细胞建立M1巨噬细胞极化模型,镜下观察THP-1细胞形态变化,应用流式细胞术检测细胞表面CD11b阳性表达率。2观察加味葛根芩连汤含药血清对M1巨噬细胞炎症因子的影响.:将细胞随机分为6组,分别是正常组（Con）,模型组（Model）,加味葛根芩连汤含药血清低剂量组（GL）,加味葛根芩连汤含药血清中剂量组（GM）,加味葛根芩连汤含药血清高剂量组（GH）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清低剂量组（LW）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清中剂量组（MW）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清高剂量组（HW）,检测各组细胞上清促炎因子IL-1β的含量变化。研究结果1 以100ng/ml PMA 叠加 LPS（100ng/ml）/IFN-y（20ng/ml）构建 THP-1 M1巨噬细胞极化模型,采用CCK8检测不同浓度含药血清孵育细胞24h后对细胞活力的影响,结果显示血清浓度增高影响细胞活力,且10%加味葛根芩连汤中剂量、高剂量含药血清血清细胞活力显着高于20%血清细胞活力,本实验拟选用10%浓度的含药血清作为后续实验的给药浓度。2细胞上清IL-1β检测结果:与正常组相比,各组IL-1β含量均显着高于正常组（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤含药血清低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-1β含量均显着低于模型组（p<0.05）;添加抑制剂后,各含药血清组IL-1β含量均显着高于未加抑制剂组（p<0.05）。研究结论三1 CCK8结果提示血清浓度增高影响细胞活力,本实验拟选用10%浓度的含药血清作为后续实验的给药浓度。2加味葛根芩连汤含药血清可直接作用于巨噬细胞,抑制LPS/IFN-γ诱导的THP-1巨噬细胞M1方向极化,降低促炎因子IL-1β的释放。添加IWR-1抑制剂后,这一抑制作用减弱,提示β-catenin可能为加味葛根芩连汤的作用靶点,加味葛根芩连汤可通能过β-catenin/FOSL2/ARID5A通路抑制M1巨噬细胞的极化。研究结论加味葛根芩连汤可能通过调控β-catenin/FOSL2/ARID5A通路蛋白表达抑制M1巨噬细胞的极化,促进炎症因子的平衡及肠上皮损伤后修复,维持肠黏膜屏障完整,缓解结肠炎症状。
王明哲[2]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中认为背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
陈嘉希[3]（2020）在《丹酚酸B预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中认为目的:观察丹酚酸B预处理对肠缺血再灌注大鼠的保护作用,并对其作用机制进行初步研究。方法:本次实验设置了阴性对照组和模型组,丹酚酸B给药组也设置相应的对照组和模型组,每组中随机配备雄性SD大鼠12只,通过夹闭肠系膜上动脉,制造肠道缺血,时间维持60min,随后再灌注24h从而得到实验所需的肠缺血再灌注模型。测定各组大鼠血清中的CAT、SOD、GSH、MDA含量,测定各组大鼠回肠组织中CAT、SOD、GSH、MDA以及TNF-α、IL-1β、IL-6等因子的含量;检测其髓过氧化物酶（MPO）活性、NF-κB p65水平;肠粘膜通透性的测定运用异硫氰酸荧光素（FITC）结合葡聚糖的方法。取1cm回肠组织的进行HE染色,观察对应切片的病理学变化,并进行Chiu’s评分;分析TNF-α、IL-1β、IL-6的含量与NF-κB p65的表达是否存在相关性;分析TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65水平与Chiu’s评分是否存在相关性。此外,还将采用RT-PCR法和Western Blot法测定各组大鼠回肠组织PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的m RNA表达以及蛋白水平。结果:1.模型组大鼠血清中MDA水平较阴性对照组明显升高,抗氧化剂SOD、CAT、GSH的含量则显着降低（P<0.01）。与模型组进行比较,丹酚酸B+模型组大鼠血清中的MDA含量显着降低,而抗氧化剂SOD、CAT、GSH的含量则有所升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.相较于阴性对照组,模型组大鼠回肠组织中MDA的含量明显升高,而抗氧化剂SOD、CAT和GSH均表现出明显下降的趋势,差异具备统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,丹酚酸B+模型组大鼠回肠组织中MDA水平大幅下降,而抗氧化剂SOD、CAT和GSH均呈现大幅升高,差异明显（P<0.01）。3.与阴性对照组比较,模型组大鼠回肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均大幅增加（P<0.01）。而丹酚酸B+模型组相较于模型组,上述指标含量均明显降低,差异具备统计学意义（P<0.01）。4.与阴性对照组比较,模型组大鼠回肠组织匀浆的MPO和NF-κB p65水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。相较于模型组,丹酚酸B+模型组大鼠的MPO水平和NF-κB p65降低,差异极显着（P<0.01）。5.与阴性对照组比较,模型组大鼠血清中的FITC-葡聚糖含量大幅增加,其粘膜通透性升高。相较于模型组,丹酚酸B+模型组大鼠血浆中的FITC-葡聚糖的含量减少,肠黏膜通透性降低,差异极显着（P<0.01）。6.与阴性对照组比较,模型组中大鼠肠道粘膜受损严重,毛细血管破裂,导致腺体功能受损,并可发现中性粒细胞浸润现象,Chiu’s的评分明显增加（P<0.01）;相较于模型组,丹酚酸B+模型组大鼠肠道黏膜轻微损伤,Chiu’s评分降低,差异极显着（P<0.01）。7.以回肠组织内IL-1β、IL-6、TNF-α含量与NF-κB p65水平的为指标,在大鼠肠缺血再灌注损伤过程中,分析二者的相关性发现呈显着的正相关,对应的相关系数依次为0.932、0.949、0.937（P<0.01）;肠缺血再灌注大鼠回肠组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB p65含量与回肠组织的Chui’s评分均呈显着正相关,相关系数分别为0.901、0.884、0.873、0.898（P<0.01）。8.与阴性对照组比较,模型组大鼠回肠组织中PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的m RNA表达降低,差异极显着（P<0.01）;对比模型组大鼠,丹酚酸B+模型组回肠组织中的PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的m RNA表达明显升高（P<0.01）。9.将模型组大鼠与阴性对照组比较可以发现,模型组大鼠回肠组织中PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组大鼠进行对比,丹酚酸B+模型组回肠组织中的PI3Kp85α和p-AKT（ser473）的蛋白水平显着升高,差异显着（P<0.01）。结论:1.丹酚酸B能够有效降低缺血再灌注对机体造成的损伤,作用机理涉及抑制氧化反应、改善肠粘膜的通透性和抑制炎症反应。2.丹酚酸B可能通过对NF-κB信号通路的调节,从而发挥其对IL-1β、IL-6、TNF-α表达的抑制作用。3.丹酚酸B可能通过调节PI3K/Akt信号通路,从而减轻、改善肠道缺血再灌注损伤。
曾慧红[4]（2020）在《雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护作用及机制》文中研究表明研究背景众所周知,机体内的消化系统和造血系统对辐射最为敏感。临床上,许多接受辐射治疗的癌症患者常伴随急性和慢性肠道及骨髓损伤,这限制了癌症的成功治疗;在核意外事故或核恐怖袭击条件下,最先损伤的系统也是消化系统和造血系统,出现急性放射综合征。虽然已有缓解辐射导致的急性造血系统损伤药物如氨磷汀（Amifostine）和优保津（Filgrastim）等在临床应用,但目前尚没有公认的能有效缓解辐射导致的急性肠道损伤药物,其主要原因是人们对辐射导致肠道损伤机制的研究不够深入,因此有必要通过了解其机制寻找新的防治方法。mTORC1信号通路作为细胞内多条通路的枢纽,参与多种重要生理病理过程,如胰岛素/胰岛素受体通路、PI3K/Akt通路和AMPK通路等。但在辐射条件下,肠黏膜上皮细胞内mTORC1信号通路是否参与辐射导致的肠道损伤?改变mTORC1信号通路状态能否保护或修复肠道的辐射损伤等问题,值得深入探讨。本文通过观察不同剂量X射线全身辐射后小鼠的生存情况和肠黏膜病理变化程度以确定后续实验的辐射剂量（第一部分）;系统观察了X射线全身辐射小鼠小肠隐窝细胞mTORC1信号通路及与此相关的细胞自噬、细胞凋亡、NF-κB信号通路和DNA损伤等病理生理变化以了解mTORC1信号通路在此过程中的作用（第二部分）;应用雷帕霉素短暂抑制辐射激活的mTORC1信号通路,观察其对小鼠存活、肠黏膜机械屏障及肠道干细胞损伤等的影响以进一步证实mTORC1信号通路的作用和作为干预药物的防护效果（第三部分）;并从细胞自噬、细胞凋亡、NF-κB信号通路和DNA损伤修复等方面深入研究雷帕霉素抑制mTORC1信号通路对肠黏膜辐射损伤保护作用的机制（第四部分）。第一部分不同剂量X射线辐射致小鼠肠黏膜损伤目的:以X射线全身辐射建立小鼠辐射模型,观察辐射对小鼠肠黏膜机械屏障和肠道干细胞的损伤。方法:120只8周C57BL/6雄性小鼠随机分为4 Gy组、8 Gy组、12 Gy组和正常对照组共4组。小鼠采用Elekta Precise直线加速器进行X射线全身一次性辐射建模,辐射总剂量分别为4 Gy、8 Gy和12 Gy,辐射速率为2.28 Gy/min。正常对照组不辐射。40只用于观察各组小鼠30天内生存情况;80只建模后取材,辐射小鼠各组观察时间点为6h,1d,2d,3d和7d。采用速率法检测血清DAO活性观察肠道通透性变化,苏木素-伊红（H-E）染色法观察各组小鼠空、回肠组织病理变化,透射电镜观察空肠黏膜上皮细胞超微结构变化,免疫组织化学染色观察Olfm4+肠道干细胞、Lysozyme+潘氏细胞和紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的分布及变化,PAS染色观察杯状细胞变化,嗜银染色观察小肠嗜银细胞变化,蛋白免疫印迹法检测ZO-1、Occludin蛋白表达变化。结果:1.随着X射线辐射剂量增加,小鼠体重降低;辐射后30天内生存率观察,辐射剂量越大,小鼠存活时间越短。12 Gy组小鼠5天内全死亡,8 Gy组14天内全部死亡,4 Gy组小鼠全部存活;2.不同剂量X射线辐射后,空肠和回肠肠绒毛出现倒伏、缩短和上皮脱落以及固有层毛细血管扩张出血等病理变化,肠上皮细胞微绒毛和细胞内线粒体等细胞器超微结构有损伤,其中12 Gy辐射损伤最严重;不同剂量辐射后空肠、回肠损伤分数均升高,且辐射剂量越大升高越明显。辐射后回肠的损伤分数变化与空肠相似,但比空肠轻。3.不同剂量X射线辐射可导致DAO活性增强,与正常对照组相比,8 Gy组和12 Gy组变化均有统计学意义（P<0.01）。4.X射线辐射均导致空肠、回肠Olfm4阳性细胞数量减少,但不同剂量的作用差异很大。4 Gy、8 Gy辐射后阳性细胞数减少后快速回升,12 Gy辐射后则持续减少。5.X射线辐射可导致空肠、回肠肠绒毛杯状细胞、嗜银细胞数量减少。与正常组相比,4 Gy组各时间点差异无统计学意义,8 Gy辐射后细胞数减少后回升,12 Gy组则持续减少（P<0.01或P<0.05）。不同剂量X射线辐射后空肠潘氏细胞数量出现先增加后减少的的变化趋势,回肠潘氏细胞数在4 Gy辐射后变化不明显,但8 Gy和12Gy辐射后阳性细胞数减少。6.通过观察8 Gy X射线辐射后肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白,各时间点均表达降低且分布异常（P<0.01）。结论:不同剂量X射线辐射均可不同程度损伤空肠、回肠肠黏膜,破坏肠黏膜机械屏障,而且造成肠道干细胞的数量减少和分化异常。第二部分mTORC1信号通路在辐射致小鼠肠黏膜损伤中的作用目的:以X射线全身辐射建立小鼠辐射模型,观察辐射对小鼠空肠隐窝细胞mTORC1信号通路、NF-κB信号通路和DNA损伤情况,探讨mTORC1信号通路在辐射肠黏膜损伤中的作用。方法:85只8周C57BL/6雄性小鼠随机分4 Gy组、8 Gy组、12 Gy组和正常对照组共四组。采用Elekta Precise直线加速器对小鼠进行X射线全身一次性辐射,建立小鼠辐射模型,辐射总剂量分别为4 Gy、8 Gy和12 Gy,辐射速率为2.28 Gy/min,辐射组小鼠观察时间点为6h,1d,2d,3d和7d,其中8 Gy增加12h观察时间点,正常对照组不辐射。各组小鼠处死前两小时腹腔注射Brd U溶液（100mg/kg）,麻醉后留取空肠标本。采用免疫组织化学法观察肠隐窝pS6表达变化、Brd U+增殖细胞数量变化、细胞核内γH2AX和53BP1阳性焦点数变化,免疫荧光双重染色观察Olfm4+小肠干细胞内pS6表达变化,TUNEL法观察肠隐窝凋亡细胞变化,蛋白免疫印迹法检测S6、pS6、mTOR、pmTOR、LC3B、p62、Akt、pAkt、p65和pp65蛋白表达变化。结果:1.不同剂量X射线全身辐射小鼠后空肠肠隐窝pS6免疫阳性蛋白积分光密度值明显高于正常组,蛋白印迹检测也显示8 Gy肠隐窝pS6、pmTOR蛋白高表达（P<0.01）;辐射后pS6和Olfm4阳性染色共同表达于同一肠道干细胞,肠隐窝细胞（包括肠道干细胞）内mTORC1信号通路被激活。2.不同剂量X线辐射均导致空肠Brd U+增殖细胞数量减少,但不同剂量的作用差异较大。4 Gy和8Gy组辐射后阳性细胞呈现降低-升高-恢复正常的变化规律,12 Gy组则持续减少（P<0.01）。不同剂量辐射后肠隐窝凋亡细胞数明显比正常组多（P<0.01或P<0.05）。3.8 Gy辐射后肠隐窝内p62表达均高于正常对照组（P<0.01）,LC3BII/LC3BI的比值较未辐射组显着降低（P<0.01或P<0.05）;辐射后细胞自噬受到显着抑制。4.与正常对照组比,8 Gy辐射后肠隐窝pAkt蛋白表达水平升高;辐射后肠隐窝pp65蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。5.8 Gy辐射后小鼠肠隐窝细胞核内γH2AX和53BP1焦点数明显高于未辐射小鼠肠隐窝细胞（P<0.01）。结论:辐射后肠隐窝细胞内mTORC1信号通路和NF-κB信号通路过度激活,细胞自噬受抑制,辐射引起肠道隐窝细胞DNA损伤和细胞凋亡。第三部分雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护作用目的:以X射线全身辐射小鼠构建辐射模型,探索雷帕霉素通过抑制mTORC1信号通路,对辐射肠黏膜损伤的保护作用。方法:90只8周C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组,单纯辐射组,雷帕霉素处理组和雷帕霉素对照组,40只用于观察小鼠30天内生存率,50只按实验需要处理小鼠并取材,采用Elekta Precise直线加速器对小鼠进行8 Gy X射线全身一次性辐射,雷帕霉素处理组全身辐射后6h给小鼠皮下注射雷帕霉素（4mg/kg）,以后隔天注射1次,雷帕霉素对照组小鼠不辐射但同时间点给药,单纯辐射组和正常对照组不给药,观察时间点为辐射后1d,3d,7d。各组小鼠麻醉后留取空肠标本,采用速率法检测血清DAO活性观察肠道通透性变化,H-E染色法观察各组小鼠空肠组织病理变化,透射电镜观察空肠黏膜上皮细胞超微结构变化,免疫组织化学观察Olfm4+肠道干细胞、Lysozyme+潘氏细胞,pS6,紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的分布及变化,免疫荧光双重染色观察Olfm4+小肠干细胞内pS6表达变化,PAS染色观察杯状细胞变化,嗜银染色观察嗜银细胞变化,蛋白免疫印迹法检测ZO-1、Occludin、S6、pS6、mTOR、pmTOR蛋白表达变化。结果:1.雷帕霉素处理后能显着降低由辐射导致的肠隐窝pS6、pmTOR蛋白高表达（P<0.01）,并可明显减弱肠隐窝和肠道干细胞辐射后增强的pS6荧光强度,能有效抑制辐射导致的肠隐窝细胞包括肠道干细胞内的mTORC1信号通路。2.雷帕霉素处理组在辐射后30天仍有30%的小鼠存活,而单纯辐射组小鼠全部死亡,雷帕霉素处理后可提高辐射小鼠生存率（P<0.05）。3.与单纯辐射组相比,雷帕霉素处理后小鼠血清DAO活性明显降低（P<0.05）;空肠黏膜的病理变化明显改善,肠绒毛增高,肠黏膜上皮细胞损伤减轻,微绒毛的形态和数量得到改善,紧密连接结构趋于正常,损伤分数显着降低（P<0.01）。4.与单纯辐射组比,雷帕霉素处理后辐射小鼠空肠肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白表达升高（P<0.01）,在肠黏膜上皮细胞间的分布增加,结构也更清晰。5.雷帕霉素处理组1天和3天Olfm4+细胞数量比辐射组少,但辐射后7天肠隐窝内肠道干细胞的数量多于辐射组（P<0.01）;辐射后,雷帕霉素处理可增加肠黏膜杯状细胞和潘氏细胞数量（P<0.01）。雷帕霉素处理促进了肠道干细胞数量及细胞分化功能的恢复。结论:短暂使用雷帕霉素可抑制辐射激活的mTORC1信号通路,促进肠道干细胞的恢复以及肠黏膜损伤的修复。第四部分雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护机制目的:以X射线全身辐射小鼠为模型,探索雷帕霉素对辐射损伤肠黏膜保护作用的机制。方法:65只8周C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组,单纯辐射组,雷帕霉素处理组和雷帕霉素对照组,采用Elekta Precise直线加速器对小鼠进行8Gy X射线全身一次性辐射,雷帕霉素处理组全身辐射后6h给小鼠皮下注射雷帕霉素（4mg/kg）,以后隔天注射1次,雷帕霉素对照组小鼠不辐射但同时间点给药,单纯辐射组和正常对照组不给药,观察时间点为辐射后12h,1d,3d,7d。各组小鼠处死前两小时腹腔注射Brd U溶液（100mg/kg）,麻醉后留取空肠标本。采用免疫组织化学法观察肠隐窝Brd U+增殖细胞数量变化、细胞核内γH2AX和53BP1阳性焦点数变化,TUNEL法观察肠隐窝凋亡细胞变化,qRT-PCR法检测肠隐窝Puma、Bcl2、Bcl-xl、Bax和Bak基因表达量的变化,蛋白免疫印迹法检测LC3B、p62、Akt、pAkt、p65和pp65蛋白表达变化。结果:1.单纯辐射组LC3BII的表达量低于LC3BI量,而雷帕霉素处理后LC3BII的表达量高于LC3BI,LC3BII/LC3BI的比值比单纯辐射组高（P<0.01）。单纯辐射组肠隐窝p62的表达明显比正常对照组高,而雷帕霉素能显着降低辐射导致的p62表达升高（P<0.01）。雷帕霉素处理组肠隐窝pAkt、pp65表达较单纯辐射组均明显减少（P<0.01或P<0.05）。2.雷帕霉素处理后小鼠肠隐窝内Brd U+细胞数较单纯辐射组明显减少,雷帕霉素能有效抑制辐射后肠隐窝细胞的过度增殖（P<0.01）,雷帕霉素处理后肠隐窝凋亡细胞数量也减少（P<0.05）。与正常对照组相比,单纯辐射后肠隐窝内表达高水平的促凋亡相关基因Puma和Bak m RNA,雷帕霉素处理能显着降低辐射后Puma和Bak m RNA的表达量（P<0.01或P<0.05）。3.雷帕霉素处理后肠隐窝细胞内γH2AX和53BP1焦点数较单纯辐射组明显减少（P<0.01）,雷帕霉素减少了辐射后肠隐窝细胞的DNA损伤。结论:mTORC1信号通路抑制剂雷帕霉素通过促进细胞自噬,抑制细胞过度增殖和凋亡,抑制激活的Akt、NF-κB信号通路,促进DNA损伤修复,以达到对辐射损伤肠黏膜的保护作用。全文结论综合以上四部分内容,全文结论如下:1.X射线全身辐射可造成实验小鼠肠黏膜病理损伤,机械屏障受损,通透性增加,肠道干细胞数量减少与分化能力下降。2.X射线全身辐射激活肠隐窝上皮mTORC1信号通路,抑制细胞自噬,激活Akt和NF-κB信号通路,加速DNA损伤和细胞凋亡产生病理变化。3.雷帕霉素通过短暂抑制X射线辐射导致的肠隐窝干细胞mTORC1信号通路激活,恢复肠道干细胞数量和分化能力,维持肠黏膜机械屏障结构的完整性,提高辐射小鼠的生存率。4.mTORC1信号通路抑制剂雷帕霉素通过促进细胞自噬,抑制激活的Akt、NF-κB信号通路和细胞凋亡,促进DNA损伤修复,以达到对辐射损伤肠黏膜的保护作用。
高亚男[5]（2020）在《联合组学技术解析黄曲霉毒素M1与赭曲霉毒素A共存损伤肠道屏障机理》文中进行了进一步梳理黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1,AFM1）是牛奶中唯一具有最大残留限量的霉菌毒素。赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）不仅常在牛奶中检出,也是谷物类食品和饲料的主要污染源之一。近年来,“牛奶+谷物（面包）”已逐步成为常见的家庭膳食模式,使得AFM1与OTA在人体内共存并产生联合作用的潜在风险也随之增加。肠道是机体抵御外来污染物入侵的第一道屏障。因此,研究混合AFM1和OTA对肠道屏障损伤作用具有重要意义。1.单独及混合的AFM1（0.12和12μM）和OTA（0.2和20μM）降低紧密连接（tight junction,TJ）蛋白的表达量、改变其细胞膜定位,破坏肠上皮细胞层完整性,使肠上皮通透性增加,混合AFM1和OTA之间存在着加和及协同作用。抑制剂干扰实验表明,霉菌毒素诱导的肠屏障损伤与p44/42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关。2.利用转录组-蛋白组联合组学分析阐明12μM的AFM1和9.9μM的OTA两种霉菌毒素在破坏肠道完整性方面具有协同作用,该协同作用与混合处理组中下调的基因和蛋白质富集到的与肠道完整性相关途径有关,包括粘着斑、粘连连接和间隙连接途径。对蛋白激酶C-α（protein kinase C,PKC-α）进行基因干扰实验,结果发现,PKC-α对于维持分化Caco-2细胞层的完整性具有重要意义。3.研究结果表明,混合12μM AFM1和9.9μM OTA在诱导炎症反应中表现为协同效应。转录组-蛋白组联合组学分析确定了3种潜在的作用机制:（i）与单独使用霉菌毒素处理组相比,混合霉菌毒素处理组诱导参与免疫相关途径的蛋白质发生更加明显的变化;（ii）相比于单独毒素,混合毒素靶向相同途径中的不同位点;（iii）相比于单独毒素,混合毒素激活了特定的炎症相关途径。4.本试验建立了单独AFM1、OTA（3.5 mg/kg b.w.）和混合AFM1+OTA（3.5 mg/kg b.w.+3.5 mg/kg b.w.）35天连续灌胃的ICR小鼠模型。霉菌毒素处理后,小鼠肠道内炎性细胞数目增多,杯状细胞数目降低,细胞间TJ蛋白定位改变,影响肠道健康的致病菌瘤胃球菌科、肠杆菌科和梭菌属丰度增加,保护肠道健康的益生菌乳酸菌属和拟普雷沃菌属丰度降低,表明小鼠肠道物理、化学、免疫及生物屏障受到损伤。综上,本研究以AFM1和OTA联合作用的危害评估为主线,以肠道屏障为研究目标,构建体外细胞和体内小鼠相结合的实验模型,发现AFM1和OTA联合作用增加对肠道毒性,并采用联合组学技术分析潜在的分子作用机制,筛选到霉菌毒素损伤肠道屏障相关的作用途径及靶蛋白。本研究结果对于建立多种霉菌毒素交互作用的风险评估方法、系统解析多种霉菌毒素交互作用对健康的危害具有重要的科学和实践意义。
张磊[6]（2020）在《枸杞多糖抑制辐射损伤小鼠小肠上皮细胞凋亡及其机制研究》文中研究表明目的电离辐射是一把双刃剑,它既可用于医学诊断和治疗疾病,同时也可以对机体造成损伤。随着恶性肿瘤发病率的不断增加,放射治疗的运用也愈发广泛。放射性肠炎（radiation enteritis,RE）是指临床上位于腹腔、盆腔和腹膜后的恶性肿瘤经过放射治疗引起正常肠组织损伤的疾病,目前临床上常用的辐射防护剂在使用中受到了种种条件限制,所以发现一种安全、价廉和有效的RE治疗方法势在必行。本研究利用中草药枸杞中的主要活性成分枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide,LBP）对辐射损伤小鼠小肠上皮细胞（Intestinal epithelial cells,IECs）进行干预,明确LBP对辐射损伤小鼠小肠上皮的防护作用,并探究LBP抑制IECs凋亡的作用及其可能存在的相关机制。方法使用直线加速器以6MV X线一次性均匀照射小鼠腹部（上界为剑突以下,下界为耻骨联合以上,其余部位用铅砖屏蔽）建立小鼠放射性肠损伤模型,把它们随机分为正常组、辐射组、低剂量LBP组（辐射+200 mg/kg LBP）,中剂量LBP组（辐射+400 mg/kg LBP）、高剂量LBP组（辐射+800 mg/kg LBP）及未辐射LBP组（800 mg/kg LBP）,通过不同浓度的LBP连续灌胃,每天1次,每次0.5ml,辐射组给予同等剂量的生理盐水,7d后制作出小鼠小肠病理切片在光镜下进行观察,为探究LBP对辐射损伤小鼠IECs凋亡的影响,应用流式细胞术（Flow cytometer,FCM）测量小鼠IECs凋亡状况,选用CCK-8法检测小鼠IECs活力,为研究LBP对辐射损伤小鼠IECs抗氧化能力,使用酶标仪检测小鼠IECs超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）的活性及丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量,最后采取蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）比较不同组别之间IECs中B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）及和Bcl-2同一家族的水溶性相关蛋白（Bax）的表达情况,探索LBP抑制放射性肠损伤小鼠IECs凋亡的可能作用机制。结果小鼠经过辐照后,小肠绒毛明显缩短,大量炎症细胞浸润,上皮连续性遭到破坏,并出现小溃疡,而经过LBP干预的各组小肠上皮都得到了不同程度的恢复,低剂量LBP组有不完整的上皮,小肠绒毛的长度较短,且密度较低。中剂量LBP组,小肠绒毛长度较短但排列却比较整齐,能够发现较为连续的上皮,当LBP浓度达到高剂量时,肠道组织近乎恢复正常水平,随着LBP剂量的不断增加,小肠组织形态也更加接近于正常组。经过LBP处理的各组[（7.39±0.58）%,（6.71±0.21）%,（5.85±0.07）%]与辐射组[（9.44±0.51）%]相比较,小鼠IECs细胞凋亡率显着降低（P<0.05）,未辐射LBP组较正常组凋亡率也较低[（4.88±0.33）%vs（5.67±0.38）%,P<0.05]。当LBP浓度达到400mg/Kg和800mg/Kg时,与辐射组（1.033±0.577）相比,中剂量LBP组（1.189±0.115）、高剂量LBP组（1.213±0.063）细胞活力均较高（P<0.05）,但中剂量LBP组与高剂量LBP组之间细胞活力并没有显着的差异。受到辐射后7 d,检测IECs细胞中抗氧化酶SOD活性。发现与辐射组[（1.13±0.08）U/ml]相比,低剂量LBP组SOD活性增加没有显着差异,中剂量LBP组[（1.32±0.06）U/ml]、高剂量LBP组[（1.53±0.03）U/ml]SOD活性均较高,并且随着LBP剂量的增加,SOD活性增强效果越明显,与正常组[（1.53±0.04）U/ml]相比,未辐射LBP组[（1.64±0.06）U/ml]SOD活性也较高（P<0.05）。随着LBP浓度的增加（200mg/kg,400mg/kg及800mg/kg）,低剂量LBP组[（9.55±0.32）nmol/mgport]、中剂量LBP组[（7.65±0.61）nmol/mgport],高剂量LBP组[（5.41±0.31）nmol/mgport]MDA含量也呈现出逐渐降低的态势（P<0.05）。使用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达情况,结果发现,与辐射组Bcl-2表达量（0.79±0.10）相比,低剂量（1.14±0.11）、中剂量（1.18±0.20）、高剂量LBP组（1.42±0.14）Bcl-2表达量明显增加（P<0.05,P<0.05,P<0.001）,低剂量（1.08±0.10）、中剂量（0.96±0.17）、高剂量LBP组（0.85±0.14）Bax表达量与辐射组（1.33±0.11）相比明显降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,与正常组（0.76±0.07）相比,未辐射LBP组（0.52±0.11）Bax表达量降低（P<0.05）。结论LBP能够保护小鼠小肠上皮,抑制小鼠辐射损伤所致IECs损伤,其机制包括提高SOD活性、降低MDA的产生来减弱氧化应激反应,同时作用于线粒体途径,使Bcl-2蛋白表达上调,Bax蛋白表达下调抑制IECs凋亡。
申思敏[7]（2020）在《甲基苯丙胺调控microRNA-181c/Tnf-α/紧密连接轴损伤肠黏膜屏障》文中研究表明[目 的]甲基苯丙胺（Methamphetamine,METH）已经取代传统毒品海洛因成为我国使用人数最多的毒品。METH可导致全身各器官、系统的损害。目前大部分METH损伤研究主要在神经系统,消化系统损伤研究极少。据临床病案报道,METH导致消化道炎症、溃疡、穿孔、出血、梗阻,并发肠源性感染等疾病。我们前期构建了 METH依赖的恒河猴模型,肠道组织苏木素-伊红染色显示肠壁变薄,结构不清,炎性细胞浸润,肠黏膜糜烂伴溃疡形,弥漫性绒毛变性、坏死,提示METH导致肠道损伤。有研究表明,METH通过产生肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）减少血管内皮紧密连接蛋白的表达,从而对血脑屏障产生毒性作用。然而,METH导致的肠黏膜屏障损伤机制研究却寥寥无几。基于此,本研究通过检测METH依赖者的临床特征和外周血肠损伤标记物、促炎因子TNF-α的表达,结合TNF-α在肠上皮细胞分子生物学实验,明确METH对肠道的损伤及损伤机制。研究促炎因子TNF-α在METH导致肠黏膜损伤中的作用,并进一步研究TNF-α上游的调控机制,为METH导致肠黏膜屏障损伤研究提供证据和新的思路。[方 法]1.在临床研究上,筛选了强制戒毒所中METH依赖者207人,其中男性193名,女性14名。采集患者一般信息和全血,血液样本用于血细胞分析、生化、肠黏膜损伤生物标志物检测和促炎因子TNF-α表达情况检测。分析METH依赖者肠黏膜屏障损伤标志物与METH依赖史、TNF-α之间的相关性。2.在细胞实验方面2.1构建细胞模型:METH处理正常大鼠肠上皮细胞IEC-6,跨膜电阻（TEER）测量仪检测不同浓度不同时间METH对肠上皮屏障的影响,CCK8检测细胞增殖活力的变化。2.2 METH造成肠屏障损伤:流式细胞仪检测METH导致细胞凋亡情况;RT-qPCR、ELISA 法及 western blotting 技术检测 METH 对上皮细胞 TNF-α,MLCK,ZO-1基因及蛋白表达的影响。2.3验证TNF-α在METH肠屏障损伤中的作用:构建TNF-α（GenBank序列NM012675）过表达/干扰质粒并转染细胞。考查TNF-α基因过表达及沉默对METH损伤肠上皮屏障通透性改变的影响,检测TNF-α、MLCK、ZO-1基因及蛋白表达情况。2.4 TNF-α上游的调控机制:在TargetScan,miRDB和microRNA数据库中筛选靶向TNF的mircoRNAs。RT-qPCR检测相关mircoRNA在METH处理的IEC-6细胞中的表达。双荧光素酶报告基因检测实验,RT-qPCR及Western blotting技术验证miR-181c-5p与TNF-α的靶向关系。2.5阐明miR-181c-5p在METH导致的肠上皮屏障损伤中的作用:在METH细胞模型上检测肠屏障损伤的表型（TEER、CCK8）。流式细胞仪、RT-qPCR、ELISA法及western blotting技术检测miR-181 c-5p对肠黏膜屏障的影响及miR-181c-5p对常见的炎症因子IFN-γ、IL-1β、IL-8的影响。[结果]1.临床研究结果与正常健康人群相比,METH依赖者血清肠黏膜屏障损伤生物标志物二胺氧化酶（DAO）,D-乳酸（DLC）和内毒素（BT）较健康对照人群显着升高,P<0.0001,差异有统计学意义。METH依赖者血清TNF-α表达水平较正常对照人群明显增高。TNF-α水平增高与DLA水平（P=0.001）正相关。同时,我们发现METH依赖者出现厌食（12.56%vs 1%）、腹痛（18.84%vs 3%）、腹胀（7.25%vs 0.5%）、便秘（17.39%vs 5.5%）、腹泻（7.25%vs 2%）、消化道出血（2.89%vs 0%）的症状和肠鸣音异常（30.43%vs2.5%）的表现显着增多;外周血红细胞计数、血红蛋白、白蛋白含量降低;炎症指标中C反应蛋白、白细胞和血小板计数、中性粒细胞百分比增多;全血免疫指标中淋巴细胞百分比降低,嗜碱性粒细胞百分比增多,流式细胞仪检测到NK细胞占总淋巴细胞的百分比也降低。METH依赖者身体质量指数BMI低于正常对照组。2.细胞实验结果2.1随着METH浓度增高和METH处理IEC-6细胞时间延长,肠上皮屏障跨膜电阻和细胞增殖活力逐渐降低。METH 0.25mM/L处理细胞48小时,TEER显着降低,细胞增殖活力亦明显降低;2.2 METH促进肠上皮细胞的凋亡,增加促炎因子TNF-α、肌动蛋白激酶MLCK和减少紧密连接蛋白ZO-1的表达导致肠上皮屏障的损坏;2.3过表达TNF-α使肠上皮屏障跨膜电阻降低,MLCK的基因和蛋白表达增加,ZO-1表达下降;干扰TNF-α具有相反的作用。TNF-α参与了 METH致肠上皮黏膜屏障损伤的过程;2.4从数据库中筛选到8个microRNAs靶向调控TNF-α。其中,mo-miR-181c-5p在METH细胞模型中表达降低。双荧光素酶报告基因检测实验和过表达miR-181c-5p使TNF-α基因及蛋白表达均降低,证实了miR-181c-5p和TNF-α的靶向关系。2.5过表达miR-181c-5p部分拮抗METH导致的肠屏障跨膜电阻的降低和细胞增殖活力的下降;减少肠上皮细胞的凋亡,降低TNF-α、MLCK的表达,增加ZO-1的表达;并且降低了炎症因子IFN-γ、IL-1β、IL-8的释放。miR-181c-5p参与调控TNF-α介导的METH所导致的肠上皮黏膜屏障损伤。[结论]1.METH依赖者消化道症状较正常人显着增多,血清肠损伤生物标志物检测指标显着升高;2.METH依赖者血清中促炎因子TNF-α的释放增加,并与DLA水平呈正相关;3.TNF-α参与了 METH导致的肠损伤,其机制是通过TNF-α/MLCK/ZO-1轴破坏肠上皮黏膜屏障;4.miR-181c-5p靶向调节TNF-α并参与细胞凋亡、紧密连接破坏过程,是引起METH肠道黏膜屏障损伤的原因之一。
李楠[8]（2019）在《靛玉红对溃疡性结肠炎模型大鼠治疗作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种病因尚未明确的非特异性炎性肠病,常发生于结、直肠,以腹痛、腹泻、里急后重及便下脓血为主要临床特点,反复发作且具有恶变倾向,已被WHO列为难治性疾病。对于本病的治疗,现有的西医治疗方案尚不能有效的控制UC发作,特别是在预防复发方面很不理想,伴随着治疗周期长,药物副反应大、治疗费用高昂等弊端,中医药对于UC的治疗在临床中收到了显着疗效。靛玉红作为中药青黛中的有效成分,是一种双吲哚类化合物,目前对其研究证实其具有抗肿瘤、抗炎等作用。本实验通过研究中药青黛中有效成分靛玉红对三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液诱导的UC模型大鼠的治疗作用,并应用分子生物学手段,观察靛玉红对大鼠结肠组织中MEK/ERK信号通路、PI3K/AKT信号通路的调节作用,以深入探讨其治疗作用机理。方法:本研究采用48只清洁级SD大鼠,♂,体质量（200±20）g,随机分为4组,分别为正常组、模型组、靛玉红组、柳氮磺吡啶（SASP）组。利用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇法建立UC模型大鼠,治疗21d后对大鼠进行疾病活动指数（DAI）评分,对大鼠结肠组织进行肉眼下大体组织观察及电镜下HE染色病理涂片观察,利用ELISA技术检测大鼠结肠粘膜髓过氧化物酶（MPO）、转化生长因子β1（TGF-β1）水平,利用RT–PCR法检测大鼠肠三叶因子（ITF）mRNA、碱性成纤维生长因子（bFGF）mRNA表达水平、利用RT-PCR及Western blot检测技术检测大鼠结肠粘膜MEKmRNA、ERKmRNA、PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK、p-AKT蛋白表达水平。结果:1.靛玉红对UC模型大鼠DAI评分影响与正常组相比,模型组DAI评分明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组、SASP组DAI评分均有明显降低（p<0.01）;与SASP组比较靛玉红组的DAI评分,差异无统计学意义（p>0.05）。2.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织结肠组织大体形态学观察、病理学HE染色的影响正常组大鼠自直肠至回盲末端均未见明显异常,见结肠肠腔通畅,无溃疡痕迹,粘膜未见充血、水肿。模型组可见巨大而深的溃疡面,受损肠壁坚硬,弹性差,呈黑褐色,近端结肠可见少量粪块滞留,溃疡面周围见粘膜水肿。经靛玉红及SASP治疗后的UC模型大鼠的结肠黏膜未见明显的溃疡面,粘膜色泽接近正常,仅于距肛门8cm处见少量粘膜充血、水肿。对大鼠结肠组织进行HE染色后发现,正常组大鼠结肠黏膜上皮完整,结构清晰,腺体排列规则,固有膜内杯状细胞丰富,未见炎症细胞浸润;模型组大鼠结肠病变组织溃疡深度可及粘膜肌层,结构破坏,隐窝细胞丢失上皮细胞脱落、坏死;固有层腺体萎缩,排列紊乱,有些腺体甚至完全丧失;黏膜及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润,且浸润全层;经靛玉红及阳性药物SASP干预后,UC模型大鼠结肠中性粒细胞及淋巴细胞浸润较模型组少,可见少量腺管扭曲,黏膜炎细胞浸润程度、腺体结构紊乱、上皮细胞缺失及溃疡程度等情况均有不同程度的改善。3.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织中MPO水平的影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中MPO水平明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中MPO水平明显降低（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。4.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织TGF-β1水平的影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中TGF-β1含量明显增高（p<0.01）。各治疗组大鼠结肠组织中TGF-β1含量均低于模型组（p<0.01）。而靛玉红组大鼠结肠组织中TGF-β1含量与SASP组相比,差异无统计学（P>0.05）。5.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织ITFmRNA与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中ITFmRNA表达水平明显降低（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中ITFmRNA表达水平明显增高（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。6.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织bFGFmRNA与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中bFGFmRNA表达水平明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中bFGFmRNA表达水平明显升高（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平均明显降低（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平明显增高（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。8.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平的影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平均明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平明显降低（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.靛玉红可以抑制UC模型大鼠肠道炎症症状靛玉红通过降低大鼠DAI评分,证明了靛玉红可以减轻UC模型大鼠肠道炎性症状,改善UC模型大鼠生存质量,验证了靛玉红对UC模型大鼠治疗的有效性。对大鼠结肠粘膜肉眼下观察大体形态,经靛玉红治疗UC模型大鼠结肠受损的溃疡粘膜愈合,改善结肠黏膜充血、水肿状态。相比于未经治疗的UC模型大鼠结肠粘膜所出现的巨大而深的溃疡面,黑褐色弹性差的肠管,治疗组大鼠结肠组织恢复良好。以此直观证明靛玉红对UC模型大鼠受损溃疡的修复功能。对大鼠结肠粘膜HE染色图片发现,经靛玉红的治疗,UC模型大鼠结肠粘膜炎症反应仅表现为少量的中性粒细胞及淋巴细胞浸润,相比于未经治疗的UC模型大鼠结肠黏膜所出现的黏膜炎细胞浸润深至粘膜肌层、腺体结构紊乱、上皮细胞缺失及溃疡程度等情况均有大幅度程度的改善。以此可以直观的证明靛玉红对UC模型大鼠结肠受损组织修复功能,以及抑制炎症的功能。2.靛玉红能下调UC模型大鼠结肠组织中TGF-β1水平TGF-β1作为生长因子超家族中的一员,具有调节细胞免疫的作用,其表达与UC疾病严重程度呈正比。靛玉红通过下调UC模型大鼠结肠组织中TGF-β1的含量,一方面可以抑制炎症细胞对UC模型大鼠结肠损伤,另一方面起到了促结肠上皮溃疡创面的愈合,组织修复的作用。3.靛玉红能下调UC模型大鼠结肠组织中MPO水平靛玉红通过下调UC模型大鼠结肠组织中MPO水平,可以说明靛玉红可有效控制UC炎症症状,减少炎性细胞浸润,MPO作为中性粒细胞嗜天青颗粒的重要组成部分,是粒细胞聚集的指标,其含量与UC肠道炎症水平呈正相关。4.靛玉红能上调UC模型大鼠结肠组织ITFmRNA表达。通过靛玉红能通过上调UC模型大鼠结肠组织ITFmRNA表达,一方面,可以说明靛玉红具有抑制肠粘膜细胞凋亡的作用,另一方面,具有对UC模型大鼠受损肠粘膜进行修复、调节细胞免疫的作用。5.靛玉红能上调UC模型大鼠结肠组织bFGFmRNA表达模型组大鼠结肠组织bFGFmRNA表达较正常组明显升高,从一个侧面说明了造模的有效性,因为在正常大鼠结肠组织中bFGFmRNA表达量极少或不表达,而由于其促炎作用的产生,通过激发NO等炎性介质介导级联反应,使得模型组大鼠结肠组织中bFGFmRNA表达量提高。通过靛玉红的治疗能够继续上调UC模型大鼠结肠组织bFGFmRNA表达,说明靛玉红能够增加血管生长因子量,从而促进新的血管生成,恢复受损粘膜完整性。6.靛玉红能提高UC模型大鼠结肠组织MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平经靛玉红治疗,可明显提高UC模型大鼠结肠组织MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平,说明靛玉红可以激活MEK/ERK信号通路,发挥其抑制细胞凋亡、促进肠粘膜细胞分化,抑制炎症反应的作用。7.靛玉红能调低UC模型大鼠结肠组织PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平靛玉红通过降低UC模型大鼠结肠组织PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平,说明靛玉红可以激活PI3K/AKT信号通路,特别是能标志性的将AKT磷酸化,完整的激活通路,发挥其抑制细胞凋亡的作用,以抑制炎症细胞进一步浸润。综上所述,靛玉红对UC模型大鼠可进行有效的治疗,其机制可能是通过下调TGF-β1、下调MPO表达水平,提高bFGFmRNA、ITFmRNA表达,激活MEK/ERK信号转导通路、PI3K/AKT信号通路,进而抗肠道细胞凋亡,抑制肠道炎症症状,促进UC所导致的肠道受损黏膜修复的作用。
王加宇[9]（2019）在《胰高血糖素样肽-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用及其机制研究》文中研究说明随着肿瘤发病率的逐年攀升,放射治疗后引起的放射性肠损伤发病率也越来越高,目前对于急性放射性肠损伤的治疗多采用综合疗法,相关药物多无针对性及特异性,且疗效欠佳,因此对于急性放射性肠损伤治疗靶点和药物的发现十分重要。已有研究表明,放射导致细胞凋亡是放射性肠炎形成的重要机制。小肠隐窝底部存在小肠干细胞,干细胞经过大约35天即可分化成为小肠上皮其它所有细胞,隐窝干细胞和小肠上皮细胞对放射线十分敏感,受照射后,很快发生凋亡,阻断或减少凋亡的发生有望成为急性放射性肠损伤的有效防治靶点。已有研究表明,胰高血糖素样肽-2（Glucagon Like Peptide-2,GLP-2）可修复照射引起的急性放射性肠损伤,但本实验前期发现照射后立即给予GLP-2,急性重度放射性肠损伤大鼠出现死亡时间早,死亡率高,表明单独应用GLP-2治疗效果差。caspase-3在凋亡过程中有非常重要的作用,Ac-DEVD-CHO化学结构中含有醛基,加入氧化剂后,醛基中的碳氢键断裂,氧化剂中的氧原子分别与碳和氢组成8个电子的共价键,形成更稳定的羧基,在体内更好发挥作用。因此本实验采用GLP-2和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO联合应用来探讨其保护作用及机制。并通过GLP-2和caspase-3激动剂PAC-1联合应用反证其作用。实验方法:1.急性放射性肠损伤模型的建立大鼠麻醉后固定于自制木板上,暴露腹部,铅砖屏蔽其他部位,60Coγ射线进行全腹部单次照射,剂量15Gy,建立急性放射性肠损伤模型。IEC-6细胞株,采用60Coγ射线进行照射,剂量10Gy,建立急性放射性肠损伤模型。2.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用研究Wistar雄性大鼠75只,随机将其分为对照组（C组）、单纯照射组（R组）、GLP-2组（G组）、GLP-2联合激动剂PAC-1组（P组）和GLP-2联合抑制剂Ac-DEVD-CHO组（D组）共5组,每组15只。于照射后立即分别给予生理盐水溶液、GLP-2溶液、PAC-1溶液和Ac-DEVD-CHO溶液,实验过程中对各组大鼠一般状态、体重和死亡率详细记录。分别于照射后1d、3d、5d和14d活杀取材,记录肠长度及肠重量。HE染色观察空肠、十二指肠和回肠组织结构变化及空肠绒毛长度和隐窝深度,免疫组织化学法检测空肠组织中Bmi-1的表达。选用IEC-6细胞株,照射前1h给予GLP-2溶液、PAC-1溶液和Ac-DEVD-CHO溶液,于照射后3h、6h和24h应用CCK8法检测IEC-6细胞的增殖情况。3.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的机制研究采用原位末端标记、免疫印迹法检测空肠组织中细胞凋亡和切割caspase-3、切割PARP-1的表达,IEC-6细胞照射后3h应用流式细胞仪检测IEC-6细胞的凋亡情况。实验结果:1.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用研究GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可显着提高照射后大鼠生存率:照射后R组在第10天开始出现死亡,死亡率15%,G组于照射后第4天出现死亡,P组于照射后第1天就出现死亡,死亡率最高,而D组无死亡。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可减轻照射后大鼠小肠组织损伤:照射后第1天,R组出现大量凋亡细胞,G组损伤较R组轻,P组损伤较R组重,D组在所有组中损伤最轻;照射后第3天,R组肠绒毛缩短、倒伏、缺失,G组绒毛损伤及长度变化较R组轻,D组在所有组中最轻,恢复最好。照射后第5天,R组肠绒毛损伤及长度有所恢复,G组较R组轻,P组较R组重,D组在所有组中最轻,恢复最好。照射后第14天,R组肠绒毛损伤及长度恢复至正常,G组较R组恢复好,P组恢复至正常,D组较C组、R组和P组恢复好GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可减轻照射后大鼠空肠组织超微结构损伤:照射后第3天,R组出现凋亡细胞,微绒毛缺失,线粒体空化,嵴断裂,G组损伤较R组轻,P组损伤较R组重,D组损伤最轻。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用减少照射后大鼠空肠组织细胞凋亡:照射后第1天,R组凋亡细胞数显着高于C组,G组凋亡细胞数低于R组,P组显着高于R组,D组低于R组和P组,但高于G组;照射后第3天,R组凋亡细胞数显着高于C组,G组低于R组,P组接近R组,D组显着低于R组;照射后第5天,R组凋亡细胞数显着高于C组,G组低于R组,P组高于R组,D组显着低于R组;照射后第14天,R组凋亡细胞数高于C组,G组低于R组,P组低于R组,D组显着低于R组。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用增加照射后大鼠空肠组织中Bmi-1表达:照射后第1天,与C组比,R组Bmi-1的表达显着降低;与R组比,G组显着升高,D组显着升高,G组和D组均显着低于C组。照射后第3天,与C组比,R组Bmi-1的表达显着降低;与R组比,G组显着升高,D组显着低于C组。照射后第5天,与C组比,R组降低;与R组比,D组显着升高,P组显着低于C组。照射后第14天,与C组比,R组降低;与R组比,D组组织中Bmi-1的表达显着升高。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用提高照射后IEC-6细胞增殖活力:照射后3h,与C组比,R组细胞增殖活力下降;与R组比,G组增殖活力显着升高,P组增殖活力显着降低,D组增殖活力显着降低,P组和D组增殖活力也均低于C组。照射后6h,P组细胞增殖活力显着低于C组和R组。照射后24h,与C组比,R组降低;与R组比,G组和P组均显着降低,D组细胞增殖活力显着升高,也显着高于C组。2.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的机制研究GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对照射后大鼠空肠组织中切割caspase-3和切割PARP-1的表达有影响:照射后第1天,与C组比,R组空肠组织中切割caspase-3表达升高,D组表达显着高于C组。照射后第3天,R组表达降低,G组、P组和D组表达显着降低。照射后第14天,各组的表达无差异。照射后第1天,与C组比,R组空肠组织中切割PARP-1表达升高;与R组比,P组的表达显着升高,D组的表达也显着升高。照射后第3天,与C组比,R组的表达显着升高。照射后第14天,P组的表达显着高于R组。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用减少照射后IEC-6细胞凋亡:照射后3h,与C组比,R组晚期凋亡率显着升高;与R组比,G组显着降低。照射后3h,与C组比,R组早期凋亡率显着升高;与R组比,G组和D组均降低,但无统计学差异,P组高于R组。结论:1 GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤有保护作用,效果明显优于GLP-2单独应用。2 GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可能通过降低cleaved caspase-3和cleaved PARP-1的表达起保护作用。
张甜[10]（2019）在《Nrf2/ARE通路在辐射性肠损伤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景放射性肠炎（Radiation Enteritis,RE）是由于腹盆腔及腹膜后恶性肿瘤患者,经射线（X线、γ射线等）放射治疗后引起的肠道损害,可累及小肠、结肠和直肠。临床上分为急性和慢性损伤,能够引起患者腹痛、腹泻,便秘,还可导致肠梗阻、肠瘘,甚至引起患者死亡,严重影响患者的生活质量。该病在国内外发生率均较高,且呈逐年上升趋势。射线导致损伤的主要因素之一是氧自由基过量产生,大量氧自由基可引起细胞功能损伤的发生并引发级联反应导致细胞凋亡,Nrf2/ARE是机体免受氧化应激损伤最重要的信号通路,该信号通路已被证实在肝、肺、肾等多组织中能够保护组织免受氧自由基损伤而产生保护作用,但对于放射性肠损伤鲜有报道,目前针对X射线诱导放射性肠损伤的研究多来自临床病例观察,损伤机制尚不清楚,围绕其发病机制的实验性研究较少,导致目前实验研究较少的主要原因是缺乏适宜的实验模型。因此,对于放射性肠损伤实验建模条件的摸索,是本课题首要研究内容,其次,Nrf2/ARE信号通路是否在肠道组织中具有保护作用及其作用机制是本课题研究的重点。研究目的1.通过摸索建立RE模型的最佳条件,建立符合临床病理特征的急性放射性肠损伤的动物和细胞模型,为放射性肠损伤的机制探索及有效治疗药物的研发奠定基础。2.通过研究Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中的动态表达和分布情况,明确该信号通路与放射性肠损伤的关系及作用。3.通过选择性干预调控Nrf2/ARE信号通路的基因表达,初步探索Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中的保护作用及其分子机制,为临床治疗放射性肠损伤提供新的靶点及思路。研究方法1.采用雄性SD大鼠及IEC-6细胞株,以不同辐射剂量的6MV-X射线单剂量照射大鼠及细胞,（1）动物模型:在整体动物学方面观察大鼠死亡情况、进食进水量、体重变化、腹泻情况,H&E检测肠黏膜组织损伤情况,采用试剂盒检测空肠组织氧化应激指标（SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性）的变化,免疫组化和免疫印迹检测空肠组织中凋亡蛋白NF-κB的表达;（2）细胞模型:采用CCK-8法检测细胞活力,最终筛选出最佳照射剂量及观察时间点,并建立放射性肠损伤动物及细胞模型条件。2.（1）Nrf2/ARE信号通路在放射性空肠组织中的动态表达和分布情况:采用雄性SD大鼠随机分为正常对照组和10Gy照射剂量组,分别在照射前及照射后1h、6h、12h、24h、48h、60h、72h、84h、96h、120h、144h、168h处死大鼠,观察不同时间点大鼠肠道损伤及H&E染色分析肠黏膜动态改变情况,qPCR法和Western Blot法检测肠组织中Nrf2及其下游分子HO-1 mRNA及蛋白动态表达情况,免疫组化检测照射后48h Nrf2和HO-1蛋白表达;（2）Nrf2/ARE的作用及意义:采用IEC-6细胞株,Nrf2抑制剂抑制细胞中Nrf2 mRNA的表达,CCK-8法检测细胞活力、Hoechst33258检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞内ROS的变化、SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性等氧化应激指标,进一步明确Nrf2的在辐射性肠损伤中的作用及意义;（3）采用全转录组基因测序分析正常大鼠与10Gy照射大鼠空肠组织全基因变化及与Nrf2相关基因差异。3.探索Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中的保护作用及其分子机制:采用P38MAPK抑制剂、ERK抑制剂、PI3K抑制剂分别对IEC-6细胞进行干预,检测不同干预组正常细胞与照射后细胞细胞活力、氧自由基、细胞凋亡及Nrf2蛋白和mRNA表达情况。研究结果1.（1）急性放射性肠损伤动物模型的建立:结果表明:照射剂量为6Gy以下时,大鼠整体动物学、氧化应激、组织病理学等各项指标变化与正常大鼠比无显着差异,照射剂量6Gy以上,随着照射剂量的增加,大鼠肠损伤显着加重,照射剂量为12Gy时,大鼠生存率仅为20%,随着照射后观察时间的推移,大鼠在照射后72h损伤最严重,84h后逐渐恢复。综合考量各项指标,10Gy照射剂量可以复制出与临床放射性肠炎症状相似的动物模型,其肠黏膜组织病理学、氧化应激及NF-κB等指标可以得出在照射后72h损伤最严重,故建立急性放射性肠损伤动物模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,源皮距100cm,观察时间点为照射后72h。（2）急性放射性肠损伤细胞模型的建立:结果表明:CCK-8细胞活力实验表明,8Gy照射细胞,细胞形态及细胞活力与正常组比较无显着差异;12Gy照射细胞,80%细胞发生核皱缩,细胞裂解死亡;而10Gy照射剂量的细胞,在照射后48h损伤最显着,细胞形态改变,细胞死亡率为50%,细胞活力降低50%,与正常细胞比较即有差异又有50%的生存率和活力。故建立急性放射性肠损伤细胞模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,细胞至放射源的距离为100cm,观察时间点为照射后24h。2.（1）Nrf2在大鼠RE中的动态变化及表达研究,结果表明:大鼠肠道损伤随照射后时间的延长而加重,照射后72h肠损伤最为显着,肠道水肿充血、肠黏膜肿胀、绒毛变短;Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达均在照射后1h显着升高,分别在照射后48h及12h达到峰值,照射后72h及24h表达有所回落,但与正常组比较仍存在显着差异;（2）Nrf2在大鼠RE中的保护作用研究,结果表明:给予Nrf2抑制剂干预后,肠上皮细胞与单一照射组比较损伤显着加重,细胞活力下降,ROS含量和细胞凋亡显着增加,氧化应激反应显着升高;（3）全转录组基因测序分析实验,结果表明:模型组大鼠有5284种基因发生改变,其中有300余种基因发生显着变化,综合分析与Nrf2相关基因,其中HO-1、MAPK、ERK及PI3K途径均有显着改变。3.探索Nrf2/ARE信号通路在RE中的保护作用及其分子机制,结果表明:不同抑制剂干预Nrf2上游途径后,与照射组（IR）比较,IEC-6辐射损伤细胞中,MAPK抑制剂组和ERK抑制剂组细胞活力、氧自由基、细胞凋亡,Nrf2蛋白和mRNA表达变化均无统计学意义,而PI3K抑制剂干预组损伤显着,细胞活力显着降低,氧自由基和细胞显着增加,Nrf2 mRNA和核蛋白表达均显着降低。研究结论1.（1）模拟临床放射性肠损伤动物模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,源皮距为100cm,观察时间点为照射后72h;（2）放射性肠损伤细胞模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,细胞至放射源的距离为100cm,观察时间点为照射后24h。2.（1）Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中具有重要的保护作用,该通路在损伤早期（照射后1h）被激活,照射后48h表达最高;并上调了其下游的抗氧化和解毒酶HO-1水平;（2）Nrf2是辐射性肠损伤的自保护机制,抑制Nrf2途径后,辐射性肠损伤显着增加。3.PI3K/Akt途径在辐射性肠损伤Nrf2/OH-1途径的激活中发挥主要作用
二、MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复（论文提纲范文）
（1）基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 巨噬细胞极化与肠黏膜屏障的相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 UC患者巨噬细胞亚群变化的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1 UC患者巨噬细胞极化特点 |
| 2 巨噬细胞极化对炎症因子的影响 |
| 3 巨噬细胞极化对肠黏膜屏障损伤的影响 |
| 4 β-catenin/ FOSL2/ARID5A通路对巨噬细胞极化的调控 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制研究 |
| 前言 |
| 第一章 在体实验研究 |
| 第一节 加味葛根芩连汤干预DSS诱导结肠炎模型的疗效观察 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 DSS诱导结肠炎疾病模型的构建与特点 |
| 2 加味葛根芩连汤对肠道炎症状态的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤对肠黏膜通透性的影响 |
| 4 加味葛根芩连汤的组方思路与特色 |
| 小结 |
| 第二节 加味葛根芩连汤对DSS诱导结肠炎巨噬细胞极化的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 加味葛根芩连汤对巨噬细胞极化的调控 |
| 2 加味葛根芩连汤对肠黏膜屏障的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤对β-catenin/FOSL2/ARID5A通路的调控 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 离体实验研究 加味葛根芩连汤含药血清对THP-1巨噬细胞极化的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1 体外巨噬细胞极化模型的构建 |
| 2 加味葛根芩连汤含药血清对细胞活力的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤含药血清对THP-1细胞IL-1β分泌的影响 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）丹酚酸B预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 缺血再灌注损伤研究概况 |
| 1.1.1 肠缺血再灌注损伤的概念 |
| 1.1.2 肠缺血再灌注损伤的发病机制 |
| 1.1.3 中医药治疗肠缺血再灌注损伤 |
| 1.1.4 西药治疗肠缺血再灌注损伤 |
| 1.2 丹参抗缺血再灌注损伤的研究概况 |
| 1.2.1 化学成分研究 |
| 1.2.2 药理作用研究 |
| 1.3 丹酚酸B的研究概况 |
| 1.3.1 丹酚酸B对心脏的药理作用 |
| 1.3.2 丹酚酸B对大脑的药理作用 |
| 1.3.3 对肝、肾的作用 |
| 1.3.4 抗癌 |
| 1.3.5 其他 |
| 1.4 立题依据 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物分组及给药 |
| 2.3.2 大鼠肠缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 2.3.3 标本收集与处理 |
| 2.3.4 血清MDA、SOD、CAT、GSH的测定 |
| 2.3.5 回肠组织MDA、SOD、CAT、GSH的测定 |
| 2.3.6 回肠组织MPO活力和促炎细胞因子的测定 |
| 2.3.7 肠通透性测定 |
| 2.3.8 小肠HE染色 |
| 2.3.9 RT-PCR测定回肠组织PI3Kp85α和 p-AKT(ser473)m RNA的表达 |
| 2.3.10 Western Blot法检测回肠组织PI3Kp85α和 p-AKT(ser473)的蛋白水平 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 丹酚酸B预处理对肠缺血再灌注大鼠血清抗氧化剂和脂质过氧化产物活性的影响 |
| 3.2 丹酚酸B预处理对肠缺血再灌注大鼠回肠抗氧化剂和脂质过氧化产物活性的影响 |
| 3.3 丹酚酸B预处理对回肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力的影响 |
| 3.4 丹酚酸B预处理对回肠组织促炎细胞因子的影响 |
| 3.5 丹酚酸B预处理对肠通透性的影响 |
| 3.6 丹酚酸B预处理对回肠病理组织学变化的影响 |
| 3.7 IL-1β、IL-6、TNF-α与 NF-p65 的相关性研究 |
| 3.8 丹酚酸B预处理对回肠组织中PI3Kp85α、p-Akt(ser473)m RNA表达的影响 |
| 3.9 丹酚酸B预处理对回肠组织中PI3Kp85α、p-Akt(ser473)蛋白水平的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 肠道缺血再灌注模型的建立 |
| 4.2 肠缺血再灌注损伤与氧化应激 |
| 4.3 肠缺血再灌注损伤与炎症反应 |
| 4.4 肠缺血再灌注与肠道黏膜损伤 |
| 4.5 肠缺血再灌注损伤与NF-κB通路 |
| 4.6 肠缺血再灌注损伤与PI3K/Akt通路 |
| 4.7 创新与不足 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 丹酚酸 B 药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
（4）雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 国内外的研究现状与存在的问题 |
| 1.2.1 辐射与肠黏膜损伤保护作用的研究现状 |
| 1.2.2 mTORC1 信号通路与DNA损伤 |
| 1.2.3 雷帕霉素对细胞的保护作用 |
| 1.3 本研究提出的假说和验证方法 |
| 第2章 不同剂量X射线辐射致小鼠肠黏膜损伤 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要药物及试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组及模型的建立 |
| 2.2.2 标本的留取 |
| 2.2.3 检测指标及方法 |
| 2.2.4 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 X射线辐射后小鼠一般情况及体重变化 |
| 2.3.2 X射线辐射后小鼠肠道组织病理形态学变化 |
| 2.3.3 X射线辐射对小鼠血清DAO活性的影响 |
| 2.3.4 X射线辐射对Olfm4~+肠道干细胞的影响 |
| 2.3.5 X射线辐射对肠道干细胞分化的影响 |
| 2.3.6 X射线辐射后肠黏膜超微结构变化 |
| 2.3.7 X射线辐射后肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Occludin变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 mTORC1 信号通路在辐射致小鼠肠黏膜损伤中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物分组及模型的建立 |
| 3.2.2 标本的留取 |
| 3.2.3 检测指标及方法 |
| 3.2.4 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 X射线辐射激活肠黏膜m TORC1 信号通路 |
| 3.3.2 辐射后肠隐窝上皮细胞增殖和凋亡变化 |
| 3.3.3 X射线辐射抑制肠隐窝细胞自噬 |
| 3.3.4 辐射激活肠隐窝Akt和 NF-κB信号通路 |
| 3.3.5 辐射造成肠隐窝细胞DNA损伤 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要实验药物及试剂 |
| 4.1.3 主要药物及试剂的配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 动物分组及模型的建立 |
| 4.2.2 标本的留取 |
| 4.2.3 检测指标及方法 |
| 4.2.4 统计学处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 雷帕霉素能有效抑制辐射导致的肠隐窝细胞过度激活的mTORC1信号通路 |
| 4.3.2 雷帕霉素延长辐射小鼠生存率 |
| 4.3.3 雷帕霉素处理后能减轻辐射导致的肠黏膜病理损伤 |
| 4.3.4 雷帕霉素处理后可降低小鼠肠黏膜通透性,改善辐射导致的肠黏膜屏障功能损伤 |
| 4.3.5 雷帕霉素处理后可促进紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的恢复,保护肠黏膜机械屏障 |
| 4.3.6 雷帕霉素促进辐射小鼠肠隐窝干细胞恢复 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 动物分组及模型的建立 |
| 5.2.2 标本的留取 |
| 5.2.3 检测指标及方法 |
| 5.2.4 统计学处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 雷帕霉素可有效促进辐射后肠隐窝细胞自噬 |
| 5.3.2 雷帕霉素应用能有效抑制辐射小鼠肠隐窝细胞Akt和 NF-κB信号 |
| 5.3.3 雷帕霉素应用能抑制辐射后隐窝细胞过度增殖和细胞凋亡 |
| 5.3.4 雷帕霉素应用能减少辐射后隐窝细胞的DNA损伤 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 进一步研究的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）联合组学技术解析黄曲霉毒素M1与赭曲霉毒素A共存损伤肠道屏障机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳及乳制品中黄曲霉毒素M1风险评估研究概况 |
| 1.1.1 AFM1理化性质及来源 |
| 1.1.2 AFM1毒性及限量 |
| 1.1.3 AFM1污染概况 |
| 1.2 谷物中赭曲霉毒素A风险评估研究概况 |
| 1.2.1 OTA理化性质及来源 |
| 1.2.2 OTA毒性及限量 |
| 1.2.3 OTA污染概况 |
| 1.3 多种霉菌毒素共存及其交互作用的研究 |
| 1.3.1 AFM1和OTA联合摄入风险 |
| 1.3.2 霉菌毒素交互作用类型的方法学研究 |
| 1.4 霉菌毒素影响肠道黏膜屏障功能的研究进展 |
| 1.4.1 霉菌毒素对肠道黏膜机械屏障功能的影响 |
| 1.4.2 霉菌毒素对肠道黏膜化学屏障功能的影响 |
| 1.4.3 霉菌毒素对肠道黏膜免疫屏障功能的影响 |
| 1.4.4 霉菌毒素对肠道黏膜生物屏障功能的影响 |
| 1.5 转录组学和蛋白组学在霉菌毒素毒性研究中的应用 |
| 1.5.1 转录组学在单独霉菌毒素毒性研究中的应用 |
| 1.5.2 蛋白组学在单独霉菌毒素毒性研究中的应用 |
| 1.5.3 组学技术在混合霉菌毒素毒性研究中的应用 |
| 1.5.4 联合组学技术在霉菌毒素毒性研究中的应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 第二章 AFM1与OTA联合作用对肠道上皮细胞层的影响 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 试验材料与试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞培养及分化 |
| 2.2.2 细胞存活率测定 |
| 2.2.3 细胞间跨膜电阻值测定 |
| 2.2.4 渗透性示踪通量测定实验 |
| 2.2.5 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.6 免疫荧光染色实验 |
| 2.2.7 紧密连接蛋白occludin基因干扰实验 |
| 2.3 数据处理 |
| 2.3.1 预期值与实测值的比较 |
| 2.3.2 交互作用类型以及相关性分析 |
| 2.3.3 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 AFM1与OTA单独及联合作用对分化Caco-2 细胞层TEER值的影响 |
| 2.4.2 AFM1与OTA单独及联合作用对分化Caco-2 细胞层通透性的影响 |
| 2.4.3 AFM1与OTA单独及联合作用对分化Caco-2 细胞层紧密连接蛋白表达量的影响 |
| 2.4.4 AFM1与OTA单独及联合作用对分化Caco-2 细胞层紧密连接蛋白定位的影响 |
| 2.4.5 AFM1与OTA交互作用类型分析 |
| 2.4.6 AFM1与OTA诱导的紧密连接蛋白与肠道通透性指标相关性分析 |
| 2.4.7 AFM1与OTA通过MAPK通路损伤分化Caco-2 细胞层完整性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 AFM1与OTA联合作用降低紧密连接蛋白表达,增加肠道通透性,损伤肠道物理屏障 |
| 2.5.2 MAPK通路参与由AFM1与OTA诱导的肠道屏障损伤 |
| 2.5.3 AFM1与OTA交互作用类型分析 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 AFM1与OTA联合作用损伤肠道屏障完整性的联合组学分析 |
| 3.1 试验材料与仪器 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细胞培养及分化 |
| 3.2.2 细胞存活率测定 |
| 3.2.3 细胞间跨膜电阻值测定 |
| 3.2.4 转录组测序 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR验证 |
| 3.2.6 蛋白质组测序 |
| 3.2.7 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.2.8 蛋白-蛋白交互作用网络分析 |
| 3.2.9 PKC-α基因干扰实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 AFM1与OTA对分化Caco-2细胞活力及TEER值影响 |
| 3.3.2 RNA质量分析 |
| 3.3.3 转录组学测序质量分析 |
| 3.3.4 AFM1与OTA诱导的分化Caco-2 细胞转录组学分析 |
| 3.3.5 蛋白质量检测 |
| 3.3.6 蛋白质鉴定质量评估 |
| 3.3.7 AFM1与OTA诱导的分化Caco-2 细胞蛋白组学分析 |
| 3.3.8 AFM1+OTA vs OTA差异基因与蛋白进行联合组学分析 |
| 3.3.9 AFM1+OTA组与OTA组共有通路分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 AFM1与OTA在破坏肠道完整性方面呈现出协同作用 |
| 3.4.2 由添加AFM1诱导的肠道上皮完整性损伤的关键调控因子 |
| 3.4.3 肠道上皮完整性损伤后诱导炎症反应 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 AFM1与OTA联合作用诱导肠道屏障炎症反应的联合组学分析 |
| 4.1 试验材料与仪器 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 细胞培养及分化 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR |
| 4.2.3 促炎细胞因子分泌量的测定 |
| 4.2.4 转录组测序 |
| 4.2.5 蛋白组测序 |
| 4.2.6 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 AFM1与OTA对分化Caco-2 细胞炎症因子分泌的影响 |
| 4.4.2 RNA质量分析 |
| 4.4.3 转录组学测序质量分析 |
| 4.4.4 AFM1与OTA诱导分化Caco-2 细胞的差异表达基因分析 |
| 4.4.5 蛋白质量分析 |
| 4.4.6 蛋白质鉴定质量评估 |
| 4.4.7 AFM1与OTA诱导分化Caco-2 细胞的差异表达蛋白分析 |
| 4.4.8 AFM1与OTA诱导的转录组学与蛋白组学联合分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 AFM1与OTA在诱导肠道炎症反应方面呈现出协同作用 |
| 4.5.2 AFM1与OTA肠道免疫毒性分子机制 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 AFM1与OTA联合作用对小鼠肠道屏障的影响 |
| 5.1 试验材料与仪器 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 试验仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 小鼠体重变化,测定脏器指数及血常规 |
| 5.2.2 肠道样品采集 |
| 5.2.3 病理组织学检查 |
| 5.2.4 杯状细胞计数 |
| 5.2.5 空肠组织免疫荧光染色 |
| 5.2.6 肠道微生物多样性检测 |
| 5.3 数据处理 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 AFM1与OTA对小鼠体增重的影响 |
| 5.4.2 AFM1与OTA对小鼠脏器指数的影响 |
| 5.4.3 AFM1与OTA对小鼠血常规的影响 |
| 5.4.4 AFM1与OTA诱导的病理组织学分析 |
| 5.4.5 AFM1与OTA对小鼠肠道杯状细胞数目的影响 |
| 5.4.6 AFM1与OTA对小鼠肠道紧密连接蛋白occludin的影响 |
| 5.4.7 AFM1与OTA 对小鼠肠道内容物微生物多样性的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 AFM1与OTA对小鼠肠道屏障的影响 |
| 5.5.2 AFM1与OTA对肠道内微生物菌群结构的影响 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）枸杞多糖抑制辐射损伤小鼠小肠上皮细胞凋亡及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 枸杞多糖对辐射损伤小鼠小肠上皮细胞凋亡的抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 枸杞多糖抑制辐射损伤小鼠小肠上皮细胞凋亡的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 多糖对细胞凋亡的调节作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（7）甲基苯丙胺调控microRNA-181c/Tnf-α/紧密连接轴损伤肠黏膜屏障（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 甲基苯丙胺依赖者的临床指标检测 |
| 引言 |
| 试剂和材料 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 甲基苯丙胺导致肠屏障损伤的分子机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 甲基苯丙胺对胃肠道的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）靛玉红对溃疡性结肠炎模型大鼠治疗作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 靛玉红对溃疡性结肠炎模型大鼠一般情况和结肠组织形态学的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 靛玉红对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织TGF- β1水平、MPO水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 靛玉红对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织ITFmRNA、bFGFmRNA表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验四 靛玉红对溃疡性结肠炎大鼠MEK/ERK通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验五 靛玉红对溃疡性结肠炎大鼠PI3K/AKT通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性自我评价及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 中医药治疗溃疡性结肠炎作用机制研究进展 |
| 综述二 靛玉红与溃疡性结肠炎关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）胰高血糖素样肽-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 GLP-2在核辐射导致急性肠损伤的保护作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）Nrf2/ARE通路在辐射性肠损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 急性放射性肠损伤模型的建立 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 分组与方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 照射条件 |
| 2.3 动物实验方法 |
| 2.4 细胞实验方法 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物实验结果 |
| 3.2 细胞实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 :NRF2/ARE通路在放射性肠损伤中的表达及其保护作用 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 分组与方法 |
| 2.1 动物实验分组 |
| 2.2 细胞实验分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 :放射性肠损伤中调控NRF2/ARE信号通路的主要机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 2 分组与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 个人简历 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
四、MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复（论文参考文献）
- [1]基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制[D]. 许琳. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]丹酚酸B预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 陈嘉希. 南昌大学, 2020(01)
- [4]雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护作用及机制[D]. 曾慧红. 南昌大学, 2020(08)
- [5]联合组学技术解析黄曲霉毒素M1与赭曲霉毒素A共存损伤肠道屏障机理[D]. 高亚男. 中国农业科学院, 2020
- [6]枸杞多糖抑制辐射损伤小鼠小肠上皮细胞凋亡及其机制研究[D]. 张磊. 重庆医科大学, 2020(02)
- [7]甲基苯丙胺调控microRNA-181c/Tnf-α/紧密连接轴损伤肠黏膜屏障[D]. 申思敏. 昆明医科大学, 2020(02)
- [8]靛玉红对溃疡性结肠炎模型大鼠治疗作用及其机制研究[D]. 李楠. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [9]胰高血糖素样肽-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用及其机制研究[D]. 王加宇. 河北北方学院, 2019(01)
- [10]Nrf2/ARE通路在辐射性肠损伤中的作用及机制研究[D]. 张甜. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)