应用LongSAGE技术进行中外猪种不同发育时期的胚胎骨骼肌比较转录谱研究

论文摘要

中外猪种在生长、胴体和肉质性状等方面存在很大差异。从遗传的角度来讲，这些表型差异在很大程度由骨骼肌生长发育过程中基因的表达状况所决定。骨骼肌的生长发育过程十分复杂，涉及许多基因和转录因子的表达及精密的网络式调控机制控制。猪瘦肉产量和质量主要取决于骨髂肌肌纤维数量和横切面积，而肌纤维数量在出生前已经基本恒定。本研究利用长标签基因表达系列分析（Long Serial Analysis of Gene Expression，LongSAGE）技术分析中外两个不同猪品种——通城猪（Tongcheng pigs，简称T）和长白猪（Landrace，简称L）不同发育时期（妊娠33，65和90天）的胚胎骨骼肌转录谱，并结合电镜技术观察其肌细胞超微结构。同时，利用GLGI方法分析未知LongSAG标签，并对差异表达的四个猪新基因进行克隆、定位和时空表达研究，初步得到如下结果：1．构建并比较分析T33（50，450）、T65（53，927）、T90（53，761）、L33（53，104）、L65（54，483）和L90（51，188）6个LongSAGE转录谱文库，共包含317，115个标签（tag），对应于98，437个单标签（unique tag）。其中，14，683个单标签至少在一个文库中检测到2个拷贝以上（含2个拷贝），平均30.87％单标签不与参考数据库中的任何序列匹配。2．表达谱聚类分析表明，6个不同的骨骼肌表达谱分为3类。L65和L90最为相似，首先聚为一类，然后与T90形成一大类。L33和T33聚为一类，T65单独成一类。通城猪出生前骨骼肌发育过程中表达谱的变化相对平缓，而长白猪在发育33-65天时变化较65-90天时急剧。3．通城猪和长白猪骨骼肌发育过程中鉴定的差异表达单标签（unique tag）分别为1，400个和1，201个（P＜0.05），其中832个特异地在通城猪中差异表达，683个特异地在长白猪中差异表达。这些品种内差异表达的标签都分别表现出八种不同的表达模式。4．骨骼肌发育过程中，差异表达基因所涉及的生物学过程在通城猪和长白猪中基本是相似的，主要涉及细胞生理过程（cellular physiological process）、代谢（metabolism）、定位（localization）、细胞通讯（cell communication）、刺激反应（response to stimulus）和发育（development）等。比较而言，通城猪中涉及的生物学过程比长白猪更多、更复杂。在通城猪中更多的差异表达基因与有机酸代谢（organic acid metabolism）（6.70％vs.0.79％，p=0.017），胺代谢（amine metabolism）（4.47％vs.0.79％，p=0.08）和氨基酸及其衍生物的代谢（amino acid and derivative metabolism）（4.47％vs.0.79％，p=0.08）有关。在长白猪中更多的差异表达基因与酒精代谢（alcohol metabolism）（5.56％vs.0.56％，p=0.009）、核酸代谢（nucleic acidmetabolism） （18.99％vs.29.37％，p=0.039）和代谢正调控（positive regulation of metabolism） （2.38％vs.0.00％，p=0.069）有关。5．骨骼肌发育过程中差异表达基因涉及的通路主要有25个，两品种涉及基因最多的都是核糖体（ribosome）通路。比较而言，在长白猪中涉及较多基因的通路是钙离子信号通路（calcium signalling pathway）、调节肌动蛋白细胞骨架（regulation of actin cytoskeleton）和碳固定（carbon fixation）等通路。而在通城猪中，较多的基因涉及附着斑（Focal adhesion）、ECM受体互作（ECM receptor interaction）和细胞凋亡（apoptosis）等通路。6．通城猪和长白猪之间差异表达标签数最多的是在妊娠65天，有653个单标签。妊娠33天和90天差异表达（P＜0.05）的单标签数目分别为532个和459个。7．利用GLGI方法对67个未知的标签进行3’延伸，获得113条EST序列。BLAST分析表明，100条EST不与任何序列匹配，这些序列可能来源于未知基因或转录本。8．分离、克隆了TOB1、FSCN1、OLFML3和NPM基因的cDNA序列，其中OLFML3还获得了第二内含子序列，NPM基因获得了第四内含子序列。用猪辐射杂种板对这些基因进行染色体精细定位。TOB1、FSCN1、OLFML3和NPM基因分别定位在猪12、3、14和16号染色体上，并分别与SS04H11（LOD=5.52）、SSC10E12（LOD=8.03）、IGLV（LOD=5.26）、SW977（LOD=9.16）标记紧密连锁。体细胞杂种板的染色体区域定位结果表明NPM基因位于SSC16q21区段。9．用实时定量PCR分析TOB1、FSCN1和OLFML3等基因的时空表达谱。TOB1基因在通城猪骨骼肌发育过程中的妊娠65天时表达量最高，其次为成年期。该基因在成年五指山猪的各种组织中广泛表达，且在骨骼肌中表达丰富。在骨骼肌发育过程中，FSCN1基因在长白猪中妊娠65天时表达量最高，在通城猪中妊娠90天时表达量最高。在成年五指山猪的组织中以大脑中表达最丰富。OLFML3基因在骨骼肌发育过程中呈下调表达，在出生后的猪骨骼肌中几乎不表达。在成年五指山猪的胃、肝和脂肪等组织中表达丰富。10．透射电子显微镜观察肌细胞超微结构表明：长白猪肌纤维的肌节明显长于通城猪。妊娠33天时胚胎骨骼肌已具有一定的肌纤维结构特征，但长白猪特征更明显，具有明显的明暗相问的带纹。妊娠65天时肌纤维发育更完善，已能清楚分辨肌节结构，长白猪糖原颗粒相对丰富。妊娠90天长白猪肌原纤维排列较通城猪紧凑。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1.文献综述
• 1.1 猪骨骼肌转录谱研究的现有基础
• 1.1.1 猪基因组测序为猪骨骼肌转录组研究打下基础
• 1.1.2 猪大量EST测序为猪骨骼肌转录组研究积累了丰富的信息
• 1.1.3 生物信息学为研究猪骨骼肌转录组提供了新的手段
• 1.2 猪骨骼肌生长发育分子基础研究现状及转录组研究必要性
• 1.2.1 猪不同胚龄骨骼肌发育的分子基础
• 1.2.2 猪不同胚龄骨骼肌全基因组转录谱研究的必要性
• 1.3 中外猪种骨骼肌转录谱比较研究的现状与意义
• 1.4 转录组研究的基因差异表达分析方法研究进展
• 1.4.1 选择性基因差异表达分析方法
• 1.4.1.1 差异显示技术（Differential display,DD）
• 1.4.1.2 代表性差异分析（Representational difference analysis,RDA）
• 1.4.1.3 抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）
• 1.4.2 全基因组转录谱分析技术
• 1.4.2.1 EST测序（EST sequencing）
• 1.4.2.2 阵列技术（Array technology）或DNA芯片（DNA chip）
• 1.4.2.3 大规模平行信号测序（Massively parallel signature sequencing,MPSS）
• 1.5 LongSAGE技术是研究转录组与发现新基因的有力手段
• 1.5.1 长标签基因表达系列分析的原理
• 1.5.1.1 SAGE技术的基本原理
• 1.5.1.2 SAGE技术的实验流程
• 1.5.1.3 SAGE数据库的分析
• 1.5.2 SAGE技术发展与LongSAGE技术的提出
• 1.5.3 SAGE技术在猪转录组研究中的应用
• 2 目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 样品收集与处理
• 3.1.1.1 分子生物学实验分析组织样
• 3.1.1.2 细胞超微结构观察用骨骼肌
• 3.1.1.3 用于新基因分离的DNA样品
• 3.1.1.4 用于基因染色体定位的DNA样品
• 3.1.2 主要试剂来源与配制
• 3.1.2.1 主要试剂
• 3.1.2.2 主要试剂的配制
• 3.1.3 菌株
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 主要分子生物学数据库及生物学软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 总RNA的提取、DNase-Ⅰ处理和检测
• 3.2.2 LongSAGE文库构建
• 3.2.3 LongSAGE文库数据分析
• 3.2.3.1 标签差异表达分析与作图
• 3.2.3.2 聚类分析
• 3.2.3.3 基因功能诠释和通路分析
• 3.2.4 qPCR验证
• 3.2.5 结合标签的基因序列延伸（GLGI）
• 3.2.5.1 GLGI用3’cDNA模板扩增
• 3.2.5.2 用GIGI将LongSAGE标签转换成3’cENA
• 3.2.5.3 GLGI产物克隆和阳性克隆鉴定
• 3.2.5.4 序列分析
• 3.2.6 四个猪新基因的分离、定位与组织表达谱分析
• 3.2.6.1 引物设计
• 3.2.6.2 PCR扩增
• 3.2.6.3 PCR产物的纯化、克隆和测序
• 3.2.6.4 DNA序列同源性检索与基因鉴定
• 3.2.6.5 四个基因物理定位的SCHP和RH法
• 3.2.6.6 新分离基因的时空表达分析
• 3.2.7 猪胚胎骨骼肌细胞超微结构
• 3.2.7.1 透射电镜观察用超薄切片标本制备
• 3.2.7.2 超微结构观察
• 4 结果
• 4.1 总RNA质量
• 4.2 LongSAGE文库构建的相关结果
• 4.2.1 双标签扩增模板最佳稀释倍数和双标签体的质量鉴定
• 4.2.2 双标签连接产生串联体
• 4.2.3 串联体的克隆和测序
• 4.2.4 标签提取与文库产生
• 4.3 文库概述
• 4.4 不同表达丰度单标签的分布
• 4.5 骨骼肌发育过程中基因表达变化趋势
• 4.6 标签序列鉴定
• 4.7 LongSAGE文库的QPCR验证
• 4.8 转录谱聚类结果
• 4.9 文库两两比较基因差异表达分析结果
• 4.9.1 差异表达标签数目
• 4.9.2 差异表达基因的GO（Gene Ontology）分析结果
• 4.10 品种内不同发育时期基因表达分析
• 4.10.1 不同发育时期骨骼肌中共表达或特异表达标签分布
• 4.10.2 差异表达标签分析
• 4.10.3 胚胎骨骼肌发育过程中差异表达基因所涉及的生物学过程和信号通路
• 4.10.3.1 生物学过程分析
• 4.10.3.2 信号通路分析
• 4.10.4 胚胎骨骼肌发育过程中品种内基因表达模式
• 4.10.4.1 通城猪中差异表达基因的表达模式分析
• 4.10.4.2 长白猪中差异表达标签的表达模式分析
• 4.10.4.3 两品种间差异表达标签的表达模式比较分析
• 4.10.5 胚胎骨骼肌发育过程中差异表达基因的品种间比较分析
• 4.10.6 某一文库中特异表达的标签
• 4.10.7 在通城猪或长白猪中特异地差异表达的标签
• 4.10.7.1 通城猪中特异地差异表达的标签
• 4.10.7.2 长白猪中特异地差异表达的标签
• 4.11 品种间相同发育时期差异表达标签分析
• 4.11.1 妊娠33天时品种间的基因差异表达
• 4.11.2 妊娠65天时品种间的基因差异表达
• 4.11.3 妊娠90天时品种间的基因差异表达
• 4.12 胚胎时期骨骼肌中高表达基因的差异表达规律
• 4.12.1 妊娠33天时品种间的差异表达规律
• 4.12.2 妊娠65天时品种间的差异表达规律
• 4.12.3 妊娠90天时品种间的差异表达规律
• 4.13 通过GLGI方法分离新的EST
• 4.14 四个猪新基因的克隆、序列分析与鉴定结果
• 4.14.1 TOB1基因片段分离、鉴定结果与序列分析
• 4.14.2 FSCN1基因片段分离、鉴定结果与序列分析
• 4.14.2.1 FSCN1基因片段PCR扩增
• 4.14.2.2 FSCN1基因序列分析
• 4.14.3 OLFML3基因片段分离、鉴定结果与序列分析
• 4.14.3.1 OLFML3基因片段PCR扩增
• 4.14.3.2 OLFML3基因部分序列分析
• 4.14.4 NPM基因片段分离、鉴定结果与序列分析
• 4.14.4.1 NPM基因片段PCR扩增
• 4.14.4.2 NPM基因序列分析
• 4.14.4.3 物种间序列相似性与系统发生树分析
• 4.14.4.4 蛋白质保守功能域预测
• 4.15 四个基因的物理定位结果
• 4.15.1 利用IMpRH的染色体精细定位结果
• 4.15.2 利用SCHP对NPM基因进行染色体区域定位结果
• 4.16 四个新分离基因的时空表达分析
• 4.16.1 TOB1基因的时空表达
• 4.16.1.1 在通城猪和长白猪的不同发育时期骨骼肌中的表达
• 4.16.1.2 在不同组织的表达分布
• 4.16.2 FSCN1基因的时空表达
• 4.16.2.1 在通城猪和长白猪的不同发育时期骨骼肌中的表达
• 4.16.2.2 在不同组织的表达分布
• 4.16.3 OLFML3基因的时空表达
• 4.16.3.1 在通城猪和长白猪的不同发育时期骨骼肌中的表达
• 4.16.3.2 在不同组织的表达分布
• 4.16.4 NPM基因的时空表达
• 4.17 通城猪和长白猪胚胎骨骼肌细胞的超微结构
• 4.17.1 妊娠33天胚胎骨骼肌细胞超微结构
• 4.17.2 妊娠65天胚胎骨骼肌细胞超微结构
• 4.17.3 妊娠90天胚胎骨骼肌细胞超微结构
• 5 讨论
• 5.1 胚胎骨骼肌发育期不同时间点的选择
• 5.2 应用LongSAGE技术进行猪骨骼肌不同发育时期转录谱分析的可行性
• 5.3 关于对不确定标签序列进行分析的策略
• 5.4 关于RNA的质量控制
• 5.5 关于实验数据的可靠性验证
• 5.5.1 验证策略的选择
• 5.5.2 内参基因的选择
• 5.5.3 定量PCR方法应用过程中应注意的事项
• 5.6 关于LongSAGE文库
• 5.7 关于LongSAGE标签鉴定基因的特异性
• 5.8 关于对GLGI技术的改进与未知标签序列的鉴定
• 5.9 关于不同发育时期骨骼肌全基因组转录谱聚类结果
• 5.10 关于胚胎骨骼肌发育中差异表达基因的表达模式
• 5.11 关于通城猪和长白猪胚胎骨骼肌发育中分子事件改变的比较
• 5.12 品种间相同发育时期骨骼肌基因表达差异
• 5.13 关于TOB1基因
• 5.14 关于FSCN1基因
• 5.15 关于OLFML3基因
• 5.16 关于NPM基因
• 5.17 关于通城猪和长白猪胚胎时期骨骼肌细胞的超微结构比较
• 6 小结
• 6.1 已经获得的结果
• 6.2 本研究的创新点与特色
• 6.3 值得进一步研究的几个相关问题
• 6.4 本研究的不足之处
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表论文题录
• 致谢