鬼臼毒素固体脂质纳米粒对人角质形成细胞增殖和凋亡作用的研究

论文摘要

背景纳米技术在疾病诊断、治疗、预防及成像等方面的广泛应用目前被美国国立健康研究院（National Institutes of Health,NIH）定义为纳米医学。纳米药物载体是纳米医学的重要前沿研究领域,它以纳米颗粒作为药物的载体,将药物包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,靶向运输至特定部位从而体现药物缓控释性及靶向性等优点,提高了药物生物利用度、减少了药剂用量,降低了药物的毒副作用。固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticle,SLN）是20世纪90年代初发展起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合纳米粒的纳米胶体载药系统。它以固态的天然或合成的脂类为载体,制成粒径约为50-1000nm的胶体给药体系,具有物理稳定性高、药物泄漏慢、毒性低等优点。由于其良好的组织相容性,又具备固体聚合物纳米粒的靶向和缓控释特性,同时其规模化生产的技术已经成熟且成本较低,此外还在可降解性和长期稳定性等多个方面显示出优势,因此是一种极有发展前景的新型药物载体制剂。尖锐湿疣（Condylomata acuminata,CA）是世界上最常见的性传播性疾病之一,发病率在20-24岁人群为0.6%-1.2%。CA由人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus,HPV）感染引起,以乳头瘤样增生为主要临床表现。据估计美国有2000万人感染人乳头瘤病毒,而且每年有超过550万新确诊病人。流行惭У鞑榉⑾衷谛曰钤救巳褐杏?5%在其一生某一时期中将感染HPV。同时反复发作的HPV感染还与宫颈癌、外阴癌、肛门癌等生殖器肿瘤密切相关。治疗方法有很多,然而由于缺乏有效的抗病毒手段,目前所有治疗方法均有较高的复发率。鬼臼毒素（Podophyllotoxin,POD）是从鬼臼树脂类木脂素中分离得到的一种具有显著细胞毒性的天然活性物质,是目前WHO推荐治疗尖锐湿疣的一线药物之一。其主要缺点是药物透皮渗透性较低,对上皮组织的靶向性较差;而且吸收后可引起严重的全身副作用,对局部正常组织的刺激性也较大,限制了其临床进一步应用。由于SLN的上述优良特性,有望给鬼臼类药物的剂型改良方面带来极大促进,更有效地发挥鬼臼类药物在治疗病毒性疾病以及相关生殖器肿瘤的防治方面的应用潜力。鉴于此,我们在广东省科技计划基金的资助下,以固体脂质纳米粒为药物载体,应用改良的溶剂乳化蒸发技术制备了鬼臼毒素固体脂质纳米粒（Podophyllotoxin-loaded solid lipid nanoparticles,POD-SLN）,并将其作用于体外培养的人皮肤角质形成细胞,观测鬼臼毒素固体脂质纳米粒抑制人角质形成细胞增殖,诱导其凋亡及其在细胞内的俘获分布,探讨鬼臼毒素固体脂质纳米粒的作用机制,从而为新型纳米药物开发及指导临床治疗提供实验依据,探索纳米科技在医学制剂载药领域的开发利用,具有较高技术含量和巨大的潜在应用前景。目的1.为提高鬼臼毒素制剂的疗效,降低其毒副作用,以棕榈酸、十八烷酰胺为脂质载体材料,应用改良的溶剂乳化蒸发法和冷冻干燥工艺制备鬼臼毒素棕榈酸固体脂质纳米粒,并对该制剂表征进行考察。2.以体外培养的人皮肤角质形成细胞为靶细胞,研究鬼臼毒素固体脂质纳米粒对人角质形成细胞增殖和凋亡的影响并观察鬼臼毒素固体脂质纳米粒在细胞的俘获分布,探讨鬼臼毒素固体脂质纳米粒对角质形成细胞的作用机制。方法1.鬼臼毒素固体脂质纳米粒的制备和表征在制备工艺研究上根据单因素考察和正交实验设计优化处方,以棕榈酸、十八烷酰胺为固体脂质载体,Brij78和大豆卵磷脂为混合表面活性剂,采用改良的溶剂乳化蒸发法和冷冻干燥工艺制备鬼臼毒素棕榈酸固体脂质纳米粒。以外观、粒径、zeta电位、包封率及稳定性进行样品表征考察。通过扫描电镜观察纳米粒粒径大小和形态;用Zeta-sizer粒径分析仪检测纳米粒粒径大小和电位;用高效液相色谱法测定纳米粒中鬼臼毒素的包封率;外观性状测定其稳定性。2.人角质形成细胞的体外培养和生物学特征取健康人包皮环切术包皮,0.02%EDTA预处理后再置于0.25%胰蛋白酶中4℃冷消化过夜,真皮刮除法分离表皮,制成细胞悬液,置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱内培养。通过倒置相差显微镜、电镜观察其形态学特征,绘制细胞生长曲线;免疫组化（ABC法）测定抗角蛋白单克隆抗体鉴定细胞。3.鬼臼毒素固体脂质纳米粒对人角质形成细胞的增殖和凋亡的影响（1）取对数生长期的人角质形成细胞,调整细胞计数为4×105/ml,加入96孔板,每孔100μl,置于37℃,5%CO2的二氧化碳培养箱内过夜,细胞贴壁后弃上清,PBS洗2次。分别加入含不同浓度的POD-SLN的培养液,使其终浓度分别为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L,空白SLN组加入等体积的空白SLN混悬液,对照组加入等体积的培养液,每孔设3个复孔,终体积200μl。置于37℃,5%CO2的二氧化碳培养箱内继续培养6、12、24、48h后,加入MTT（5g/L）20μl/孔,置于37℃,5%CO2的二氧化碳培养箱内继续孵育4h。加入DMSO 200μl/孔,振荡10min,测A值（λ=570nm）。（2）取对数生长期的人角质形成细胞,调整细胞计数为4×105/ml,加入96孔板,每孔100μl,置于37℃,5%CO2的二氧化碳培养箱内过夜。分别加入含不同浓度的POD-SLN和POD的培养液,使其终浓度分别为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L。每孔均设3个复孔,终体积200μl。培养48h后,MTT比色法测定POD-SLN和POD对细胞增殖的抑制作用。（3）细胞准备同上,加入6孔板,分别加入含不同浓度的POD-SLN和POD的培养液,两组的终浓度均为10μg/L,,对照组加入等体积的培养液,置于37℃,5%CO2的二氧化碳培养箱内继续孵育24h,将培养的人角质形成细胞用胰酶消化后置5ml试管中,PBS洗2次,加PRMI1640培养液制成单细胞悬液,调整细胞数为5×105个细胞,加入5μl Annexin V—FITC和5μl PI,室温下避光染色5min,流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡。（4）细胞准备和分组同上,在药物作用24h后,加100μl PBS调整细胞浓度,每份5×105个细胞。加入1ml PI染料（浓度为5g/L）,室温下避光染色15min,流式细胞术（FCM）检测细胞周期。（5）取对数生长期的角质形成细胞,分别加入含不同浓度的POD-SLN和POD的培养液,使其终浓度均为10μg/L,空白SLN组加入等体积的空白SLN混悬液,对照组加入等体积的培养液,37℃继续培养24h,2.5%戊二醛固定,透射电镜观察鬼臼毒素固体脂质纳米粒作用后的细胞超微结构的变化。（6）取对数生长期的角质形成细胞,接种于内置有盖玻片的6孔板中,分别加入含不同浓度的POD-SLN和POD的培养液,使其终浓度均为10μg/L,空白SLN组加入等体积的空白SLN混悬液,对照组加入等体积的培养液,37℃继续培养24h,加入4%多聚甲醛固定10min,PBS轻洗3次,加10μlAnnexin V—FITC,室温下避光染色10min。荧光显微镜下观察凋亡细胞。（7）取对数生长期的角质形成细胞,接种于内置有盖玻片的共聚焦显微镜专用培养皿内,分别加入含不同浓度的POD-SLN和POD的培养液,使其终浓度均为10μg/L,空白SLN组加入等体积的空白SLN混悬液,对照组加入等体积的培养液,37℃继续培养12h,激光共聚焦显微镜观察鬼臼毒素固体脂质纳米粒在人角质形成细胞的俘获分布。4.统计学处理以SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计分析,计量资料以（?）±S表示;两组间均数比较采用两独立样本t检验（Independent—Samples TTest）.,分析各处理方式的主效应及交互效应采用重复测量的方差分析（Repeatedmeasure）;多组组间显著性检验采用单因素方差分析（One—Way ANOVA）,多重比较方差齐性时用Bonferroni检验,方差不齐时用Tamhane’s T2检验。当P≤0.05时,差异有统计学意义。结果1.制备的POD-SLN混悬液呈外观均一、稳定的半透明胶体状分散体系,略带淡乳白色金属光泽。电镜下基本呈圆形或类圆形,经Zeta-siser3000HS型粒径分析仪检测POD-SLN混悬液平均粒径为87.2±10.29nm,Zeta电位25.27±0.78mv。POD-SLN冻干剂重新得到的混悬液平均粒径113.58±5.40nm,Zeta电位23.73±1.92mv。经两独立样本t检验粒径之间差异有统计学意义（t=5.563,P=0.000）;Zeta电位之间差异无统计学意义（t=1.812,P=0.115）。放置于40C冰箱6个月后的POD-SLN混悬液和冻干剂样本粒径分别为227.78±13.03nm,123.38±9.46nm;室温6个月后的粒径分别为436.28±30.76nm,164.12±12.69nm,经两独立样本t检验,差异有统计学意义（P=0.000）。高效液相色谱法测定纳米粒中POD的平均包封率为83.24%±2.44%。2.体外培养的人皮肤角质形成细胞经过1—2天的潜伏期,即进入指数增生期,持续约5天,然后进入平台期。第7天左右细胞完全融合连成片状,形态呈扁平不规则多边形,状似鹅卵石,免疫组织化学显示胞浆被染成棕黄色,为角蛋白阳性。透射电镜下见角质形成细胞胞浆内有大量束状张力纤维呈典型角质形成细胞特征。3.POD-SLN明显抑制人角质形成细胞的生长,并呈时间和浓度依赖性。重复测量的方差分析显示各不同时间的主效应差异有统计学意义（F=16.827,P=0.000）,各组之间的主效应差异有统计学意义（F=94.462,P=0.000）,各时间点与各组之间的交互效应差异也有统计学意义（F=7.223,P=0.000）。在同一浓度随作用时间延长,A值降低,抑制率升高;在同一时间点随药物浓度的增加,A值亦降低,抑制率升高。单因素方差分析提示在12、24、48h各组之间差异有统计学意义（P=0.000）。Bonferroni法各组间比较发现与对照组相比,在48h时POD-SLN 0.1μg/L即对人角质形成细胞产生抑制作用,差异有统计学意义（P=0.000）;另外,空白固体脂质纳米粒组与空白对照组两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。4.POD-SLN和POD均抑制人角质形成细胞的增殖,两独立样本T检验比较在0.1、1、10、100、1000μg/L浓度下,POD-SLN对人角质形成细胞增殖的抑制作用均高于POD,差异有统计学意义（P＜0.05）。作用48h对人角质形成细胞的抑制率最高分别为91.01±1.60%、68.32±1.46%（P=0.000）。5.药物处理人角质形成细胞24h后,单因素方差分析显示各组的细胞凋亡率不相同（P=0.000）。Bonferroni法各组间比较发现与对照组相比,POD和POD-SLN均能够显著促进细胞凋亡,差异有统计学意义（P＜0.01）,总凋亡率分别达59.65±5.24%和81.40±8.01%。POD-SLN诱导细胞凋亡的效果优于POD,并且以早期凋亡为主（P＜0.01）。6.药物处理人皮肤角质形成细胞24h后,单因素方差分析显示各组的细胞周期相不相同（P=0.000）。POD-SLN和POD均导致细胞周期阻滞,表现为G0-G1期细胞分布降低,S期细胞和G2-M期细胞分布明显增加,以G2-M期增加为主。Bonferroni法各组间比较发现与对照组相比,G0-G1期细胞分布由82.66±1.64%分别下降至4.11±0.92%和4.03±1.03%,S期细胞分布由5.30±2.11%分别增至27.19±5.90%和22.98±4.39%;G2-M期细胞分布由7.25±1.59%分别增至63.11±6.63%和60.09±2.40%;差异有统计学意义（P＜0.01）。POD-SLN及POD两组之间对细胞周期的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。7.与正常细胞相比,可见药物作用后的角质形成细胞出现胞浆内空泡增多,线粒体肿大,空白固体脂质纳米粒作用的细胞也发现线粒体增多,稍肿大（图4-5）,鬼臼毒素固体脂质纳米粒和鬼臼毒素与角质形成细胞作用24h后出现细胞膜溶解,细胞核碎裂、核固缩,细胞表面微绒毛消失等细胞凋亡现象。免疫荧光法检测结果表明POD-SLN和POD与角质形成细胞作用24h后,细胞膜出现片状或颗粒性绿色荧光。激光共聚焦显微镜下观察到,在培养液中的终浓度相同的情况下,POD-SLN和POD与角质形成细胞作用12h后,均呈现红色荧光聚集在细胞核的倾向,并且POD-SLN较POD的荧光强度增高。结论1.采用改良的溶剂乳化蒸发法及冷冻干燥工艺制备的鬼臼毒素固体脂质纳米粒,经过粒径、电镜、包封率及稳定性考察,外观均一,大小符合要求,包封率及稳定性较好,从而可以获得质量更高的产品,为将来制剂的大规模生产奠定基础。2.POD-SLN呈时间和浓度依赖性抑制人角质形成细胞增殖,并能诱导细胞产生凋亡。3.POD-SLN较POD对角质形成细胞具有更强的增殖抑制作用和诱导凋亡的效应。能够识别并进入细胞内,集中于细胞核区。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒的制备和表征
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 人角质形成细胞的体外培养及生物学特征
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒对人角质形成细胞体外增殖和凋亡的影响
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 英文缩写词对照表
• 成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明