水牛生精上皮细胞体外培养的初步研究

论文摘要

为建立水牛精原细胞增殖及分化的培养体系,本研究以本地水牛睾丸为材料,进行了如下研究:（1）探讨了水牛曲精细管发育过程中的细胞类型变化规律。结果发现,水牛出生后曲精细管的直径逐渐增大,由初生时的37.5～50.0μm增大到10～12月龄的125.0～150.0μm,生精细胞由初生时的单一性原细胞逐步分化形成精原细胞、精子细胞和精子,其中3～5月龄水牛曲精细管的直径约为75.0～87.5μm,生精细胞主要为精原细胞,是研究精原细胞分离培养的最佳材料。（2）探讨了水牛睾丸支持细胞的分离、纯化培养方法。结果发现,3～5月龄水牛睾丸组织采用胶原酶、胰蛋白酶两步法消化后,平均每克组织得到2.61×106个细胞,平均活率为89.37%;用差异黏附法和高温培养法（38.5℃培养24h）纯化后,支持细胞纯度达90%以上;RT-PCR检测及测序发现,支持细胞表达GATA4,GDNF,而精原细胞表达GDNF受体。（3）探讨了水牛精原细胞的分离、纯化及培养方法。结果发现,曲精细管片段培养极容易漂浮,而组合酶消化后再培养,所得精原细胞较多;Percoll纯化后精原细胞纯度可达62.95%;AKP染色显示,支持细胞呈阴性,管周样细胞和未分化的精原细胞呈阳性,分化的精原细胞表达C-Kit;精原细胞培养4wk后出现单倍体精子细胞,经RT-PCR检测证实,获得单倍体精子细胞特有的基因PRM-2。以上结果表明,（1）随着水牛睾丸曲精细管的发育,其细胞组合类型发生明显改变,3～5月龄水牛的睾丸曲精细管主要为精原细胞,可用于分离精原细胞;（2）差异黏附法和高温培养法可用于纯化培养水牛支持细胞;（3）组合酶消化培养法培养精原细胞效果优于曲精细管片段法;（4）AKP染色以及C-Kit检测可以鉴定水牛睾丸体细胞,分化及未分化型的精原细胞;（5）水牛精原细胞可用Percoll进行纯化,经体外培养可分裂、分化形成精子细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 哺乳动物精子体外发生研究进展（文献综述部分）
• 第一节 精原细胞的研究进展
• 1.1 曲精细管上皮周期
• 1.2 精原细胞概念
• 1.3 细胞间桥
• 1.4 精原细胞的增殖及分化潜能
• 1.6 精原细胞鉴定
• 1.7 精原细胞体外培养分化的研究
• 1.8 精原细胞培养的应用前景
• 1.9 展望
• 第二节 支持细胞研究进展
• 2.1 支持细胞结构及类型
• 2.2 支持细胞的增殖
• 2.3 支持细胞的鉴定
• 2.4 支持细胞功能
• 2.5 支持细胞培养的应用前景
• 2.6 本实验研究的目的及意义
• 第二章 哺乳动物精子体外发生研究进展（实验部分）
• 第一节 水牛生精上皮细胞分离及支持细胞培养
• 1.1 材料与方法
• 1.2 试验设计
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二节 水牛精原细胞分离、纯化及培养
• 2.1 材料与方法
• 2.2 试验设计
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 参考文献
• 附录 图片
• 缩略词（中英文对照表）
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况