芳樟油气相抗菌机制的研究

论文摘要

采用直接接触法和气相熏蒸法分别对比芳樟油与其他植物精油对呼吸道致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌）的抗菌能力,芳樟油对各种供试菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌）都有显著的抗菌作用,其综合抗菌能力与茶树油相似,在供试植物精油中抗菌效果最好。其中以气相抗菌能力更为明显,对大肠杆菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌的效果最为显著,最小杀菌浓度（MBC）为250μl/L,肺炎克雷伯氏菌其次（MBC为500μl/L）,铜绿假单胞菌对供试的所有精油均不敏感,芳樟油对其的MBC为4500μl/L。大肠杆菌经芳樟油熏蒸处理后微观形态发生了明显的变化,芳樟油使细胞膜结构破坏,导致细胞通透性增加,胞内物质外漏,进而造成菌体外形出现萎缩。通过SEM观察发现,经芳樟油熏蒸处理后大肠杆菌菌体表面形态发生明显改变,细胞壁表面不光滑,呈现皱缩、干瘪状态；TEM观察结果为细胞壁结构完整,但细胞膜出现局部破裂导致胞浆内物质外漏,使其与细胞壁出现明显分离,胞壁外形不平边缘模糊粗糙,胞浆变得不均匀分布,胞质胞核固缩胞浆电子密度增强,甚至有些菌体胞壁完全破裂溶解,胞浆内物质外漏甚至出现部分“空穴”,细胞重度变形皱缩形状凹凸不平。细胞膜渗透性用结晶紫、电导率试验进行检测,结果发现芳樟油具有高效气相杀菌能力,其MIC浓度（200μl/L）能在短时间内使大肠杆菌致死：其挥发性组分能对大肠杆菌细胞膜产生很大的作用,破坏膜结构,增强膜渗透性,对外界大分子物质结晶紫的吸收程度增加、胞内离子外泄,当达到一定程度时,即可杀灭大肠杆菌。荧光光谱和FTIR研究表明,芳樟油气相熏蒸处理影响大肠杆菌的菌体蛋白三级、二级结构。芳樟油处理使大肠杆菌膜蛋白内源荧光强度变化,表明芳樟油引起蛋白质的三级结构的变化,且表现出较强规律性。在一定浓度和时间内,大肠杆菌荧光强度随着芳樟油的浓度增加和时间延长呈不同程度的增加。适当的芳樟油处理可以使膜蛋白分子伸展,浓度过大会使膜蛋白发生卷曲、折叠。导致的二级结构变化为α-螺旋含量降低,而β-折叠增加,说明芳樟油可使分子内部氢键的排列取向发生变化,使多肽链中α-螺旋结构伸展而变成线性结构。然而,气相芳樟油作用并不能无限使蛋白分子内的α-螺旋结构向β-折叠转变,而是一定相对含量后就不再发生显著变化,这说明芳樟油只能改变大肠杆菌部分菌体蛋白的二级结构。FTIR的研究说明芳樟油气相熏蒸处理会对菌体的其他生物大分子（磷脂、核酸、多糖等）都有作用,用脂质过氧化试验检测芳樟油对菌体脂质的影响发现：芳樟油对膜脂没有明显的过氧化作用,表明芳樟油的抗菌作用不是由膜脂过氧化引起的。对芳樟油进行成分分析：相对含量较高的化学成分有芳樟醇（35.17%）、樟脑（15.36%）、1,8-桉叶油素（13.73%）、黄樟素（8.34%）、α-松油醇（3.67%）、橙花叔醇（3.54%）、柠檬烯（3.16%）、桧烯（2.91%）、α-蒎烯（2.12%）等,共占总化学成分含量的88.88%。用SPME-GC/MS分析其气相组分（含量10%以上）主要为芳樟醇（69.94%）、樟脑（10.90%）、橙花叔醇（10.92%）而这些单体的抗菌实验发现,三种物质中仅芳樟醇在供试浓度范围内（3000μl/L）表现出抗菌活性,MIC值为200μl/L。芳樟油中的气相抗菌能力主要来自芳樟醇。对芳樟醇、樟脑、橙花叔醇进行量子化学分析发现,芳樟醇的前言轨道能量差最大,抗菌活性最强。通过电子云密度和Fukui函数进一步发现芳樟醇O原子的电子云密度最高,具有强亲电、亲自由基的能力,其亲电性更显著。因此,芳樟醇中的羟基是抑菌活性中心,在电子转移过程中起提供电子的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• CATALOGUE
• 第一章 绪论
• 1.1 芳樟油的概述
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 芳樟油的功能特性及应用
• 1.1.3 樟树提取物抗菌杀虫研究进展
• 1.2 气相抗菌剂的研究进展
• 1.2.1 空气消毒杀菌的常见方法
• 1.2.2 植物提取物气相抗菌研究进展
• 1.2.3 植物提取物在空气消毒方面的应用研究
• 1.2.4 植物精油气相抗菌的应用研究
• 1.3 抗菌作用机理的研究进展
• 1.3.1 抗菌作用机理
• 1.3.2 抗菌作用机理的研究方法
• 1.3.3 国内外植物精油抗菌作用机理研究进展
• 1.4 立题背景、研究意义和主要研究内容
• 1.4.1 研究意义及创新点
• 1.4.2 主要研究内容
• 1.5 技术路线
• 第二章 芳樟油抗菌作用评价
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 培养基及仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 芳樟油对革兰氏阴性菌抗菌作用与其他植物精油的比较
• 2.3.2 芳樟油对革兰氏阳性菌抗菌作用与其他植物精油的比较
• 2.3.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 第三章 芳樟油对E.coli显微结构及渗透作用的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 试剂及仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 SEM观察芳樟油对大肠杆菌超微结构的影响
• 3.3.2 TEM观察芳樟油对大肠杆菌超微结构的影响
• 3.3.3 芳樟油对大肠杆菌菌体渗透性的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 芳樟油对E.coli细胞膜生物大分子的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 试剂及仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 FTIR分析芳樟油熏蒸大肠杆菌生物大分子结构基团的影响
• 4.3.2 芳樟油对大肠杆菌菌体蛋白三级结构的影响
• 4.3.3 芳樟油对大肠杆菌菌体蛋白二级结构的影响
• 4.3.4 脂质过氧化
• 4.4 本章小结
• 第五章 芳樟油成分分析及主要成分抗菌作用量子分析
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂及仪器
• 5.2.3 实验方法
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 芳樟油GC/MS分析结果
• 5.3.2 芳樟油气相氛围GC/MS分析结果
• 5.3.3 芳樟油气相主成分的抗菌活性研究
• 5.3.4 芳樟油气相抗菌主成分的确立的量子分析
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢