瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及功能研究

论文摘要

燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac）引起的细菌性果斑病是瓜类生产上的一种严重的病害,主要危害西、甜瓜的叶片和果实,产生大量病斑并造成果实腐烂,常造成毁灭性的后果。近年来,瓜类细菌性果斑病在我国新疆、内蒙古、海南、吉林、宁夏等地严重发生,并有上升趋势,对我国甜瓜、西瓜及其他葫芦科作物的生产构成了严重的威胁,已经成为阻碍和限制瓜类作物进一步发展的首要障碍,尤其是在以西瓜、哈密瓜为重要经济作物的新疆地区。因此,需要我们尽快找到相应的防治措施,而对瓜类细菌性果斑病菌致病机理的研究则对该病害的防治具有重要的指导意义。目前,对瓜类细菌性果斑病菌的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测方法和技术、抗病品种的鉴定等方面。本课题组首次从果斑病菌中鉴定到了酰基高丝氨酸内酯类化合物（acyl-homoserine lactones,简称AHLs）介导的群体感应（quorum sensing,简称QS）调节系统,并初步明确了该系统对病原菌致病性的影响。然而,对果斑病菌致病的分子机理仍然知之甚少。本研究根据丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）DC3000中新的毒性基因tvrR （TetR-like virulence regulator）的序列,利用生物信息学知识,从瓜类细菌性果斑病菌（A. avenae subsp. citrulli, Aac）的全基因组中克隆到tvrR基因的同源物。通过同源重组的方法,构建了tvrR基因的插入突变体,并且经过PCR及Southern杂交验证确认。对胞外多糖的产量、菌体游动性和25%葡萄糖的趋化应答能力检测发现,突变体的胞外多糖产量、游动性和趋化能力与野生型菌株相比没有明显差异。烟草过敏反应检测显示,突变体和野生型菌株一样可以激发非寄主的过敏性反应。致病性试验结果显示,突变体比野生型菌株发病晚,病程延长,但最终致病情况与野生型无差异。接种的寄主组织中菌体生长能力检测发现,突变体的繁殖速度慢于野生型,但最终其菌体数量也能达到野生型菌株的最大值。在营养丰富的LB培养基和营养贫乏的MMX基本培养基中生长测定均发现,突变体生长速度慢于野生型,但最终也能达到野生型的最大生长量。瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因突变体致病性的改变与其生长能力变化的一致性表明,其致病性的变化是由于其生长能力的改变引起的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 瓜类细菌性果斑病菌研究进展
• 1.瓜类细菌性果斑病简史
• 2.病原菌生物学和生理生化特性
• 3.寄主范围与地理分布
• 4.危害与症状特点
• 5.传播及侵染循环
• 6.1 回避
• 6.2 杜绝
• 6.3 保护
• 6.4 抵抗
• 6.5 治疗
• 6.6 农业措施
• 7.研究现状
• 第二部分 研究内容
• 第一章 瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.2.1 培养基的配置
• 1.2.2 菌株的活化、培养及保存 #16·
• 1.2.3 抗生素及其使用浓度
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 tvrR基因的克隆
• 1.4.1 细菌基因组DNA的提取
• 1.4.2 PCR扩增
• 1.4.3 PCR产物回收、纯化
• 1.4.4 pMD19-T载体的连接
• 1.4.5 质粒的转化
• 1.4.6 PCR扩增验证
• 1.4.7 基因序列测定和分析
• 1.5 tvrR基因插入突变体的构建
• 1.5.1 单交换DNA片段tvrR-S的克隆
• 1.5.2 自杀载体的构建
• 1.5.3 突变体的构建
• 1.6 突变体的验证
• 1.6.1 PCR验证
• 1.6.2 Southern杂交验证
• 1.7 互补菌株的构建
• 1.7.1 互补DNA片段tvrR-C的克隆
• 1.7.2 氯霉素抗性基因cm的克隆
• 1.7.3 表达载体的构建
• 1.7.4 互补菌株的构建
• 1.8 互补菌株的验证
• 1.8.1 互补DNA片段tvrR-C的酶切验证
• 1.8.2 氯霉素抗性基因cm的酶切验证
• 1.8.3 DNA片段tvrR-C-cm的酶切验证
• 1.9 tvrR基因突变对果斑菌的影响
• 1.9.1 生物膜生成情况的检测
• 1.9.2 胞外多糖分泌量的检测
• 1.9.3 游动性和趋化性检测
• 1.9.4 致病性、菌体生长能力和烟草过敏反应检测
• 1.9.5 在不同培养基内生长测定
• 2 结果与分析
• 2.1 tvrR基因的克隆和分析
• 2.2 tvrR基因插入突变体的构建
• 2.2.1 自杀载体的构建
• 2.2.2 突变体的构建
• 2.3 突变体的验证
• 2.3.1 PCR验证
• 2.3.2 Southern杂交验证
• 2.4 互补菌株的构建及验证
• 2.4.1 互补菌株的构建
• 2.4.2 互补菌株的验证
• 2.5 tvrR基因突变对果斑菌的影响
• 2.5.1 tvrR基因突变不影响果斑菌生物膜的形成
• 2.5.2 tvrR基因突变不影响果斑菌胞外多糖的产生
• 2.5.3 tvrR基因突变不影响果斑菌的游动性和趋化性
• 2.5.4 tvrR基因突变影响果斑菌的致病性
• 2.5.5 tvrR基因突变影响果斑菌在寄主组织中的生长
• 2.5.6 tvrR基因突变影响果斑菌在不同培养基中的生长
• 3 讨论
• 附录一 丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000 attM同源基因的克隆及功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 attM同源基因的克隆
• 1.5 表达载体的构建
• 1.6 attM同源基因编码产物对信号分子AHL降解作用的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 attM同源基因的克隆
• 2.2 attM同源基因的序列分析
• 2.3 表达载体的构建及验证
• 2.4 attM同源基因编码的产物不能降解R10产生的信号分子AHL
• 3 讨论
• 附录二 tvrR同源基因及attM同源基因序列
• 参考文献
• 致谢