菹草红色类胡萝卜素的结构表征及其抽提物生理活性研究

论文题目: 菹草红色类胡萝卜素的结构表征及其抽提物生理活性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 农产品加工及贮藏工程

作者: 王海滨

导师: 张声华

关键词: 菹草,红心鸭蛋,菹草类胡萝卜素抽提物,红色类胡萝卜素,紫杉紫素,分离纯化,结构表征,肝癌细胞,细胞凋亡,菹草功能性红心蛋颗粒饲料

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 菹草（Potamogeton crispus L.）是眼子菜科沉水维管柬植物,广泛分布于湖泊、水库和沟渠等地,湖区的蛋鸭采食菹草后能生产优质的红心鸭蛋,但其原因一直不明。而且鲜菹草生长的季节性很强,因而红心蛋的生产受到很大限制。国内外大量研究表明,蛋黄色泽与饲料中类胡萝卜素的种类和含量密切相关。类胡萝卜素不仅是重要的天然色素,而且具有抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤细胞生长等生物活性。本实验室的初步研究表明:这种红心蛋的类胡萝卜素提取物可显著抑制肿瘤细胞S180的生长,因此对菹草类胡萝卜素进行深入系统的研究具有重要意义。本课题综合运用了化学分析、色谱、光谱及质谱等现代仪器分析技术和方法,将菹草和红心鸭蛋中的类胡萝卜素进行了对比研究,确定了菹草中特殊红色类胡萝卜素的化学结构;采用细胞分子生物学前沿技术和手段,探讨了菹草类胡萝卜素抽提物对人肝癌细胞株QGY-7703生长抑制和对癌细胞凋亡的影响;运用食品及饲料加工新技术,研制开发了红心蛋专用菹草功能颗粒饲料。本研究为深度开发利用菹草资源、实现菹草颗粒饲料及红心蛋功能产品的产业化奠定了坚实基础。主要研究内容及成果如下: 1 对菹草和红心鸭蛋蛋黄类胡萝卜素的特性进行了初步比较研究,建立了菹草红色类胡萝卜素的分离、纯化和制备方法 1.1 用有机溶剂浸提冻干菹草类胡萝卜素的最佳参数条件是:浸提液为石油醚—丙酮（1∶3,v/v）混合溶剂,料液比为90（mL/g）,在常温下分3次浸提,总浸提时间为1.5 h。冻干菹草粉总类胡萝卜素的含量为552.57mg/kg,在此条件下其总类胡萝卜素的提取率可达95.5%。 1.2 菹草中的红色类胡萝卜素和部分黄色类胡萝卜素与采食菹草的蛋鸭所产红心蛋蛋黄色素有很好的对应关系,此红心鸭蛋的红色类胡萝卜素来源于菹草。 1.3 采用氧化镁-硅藻土（1∶2,w/w）柱层析、硅胶G薄层层析可从菹草总类胡萝卜素中分离纯化得到3个红色类胡萝卜素组分r1、r2和r3,其Rr分别为0.32、0.34和0.38;薄层层析展开剂为正己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲醇=27∶4∶2∶2（v/v/v/v）。 2 对菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的化学结构进行了表征 用紫外可见吸收光谱、红外光谱、拉曼光谱、高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析、低分辨和高分辨电子轰击质谱及其它理化分析研究了菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的化学特性和结构,主要结论是: 2.1 r1、r2和r3在丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二硫化碳中的紫外可见吸收光谱均为比较平滑对称的单峰(对应的最大吸收波长为λmax),在正己烷中则呈现不对称“三指状”谱峰的趋势,与正己烷相比,随溶剂极性增强,λmax增大;从总体平均趋势看:r1、r2和r3的λmax依次减小（蓝移）几个nm。r1、r2和r3的红外光谱表明它们是

论文目录:

目录

中文摘要、关键词

英文摘要、关键词

缩略语表

第一章 前言

1 问题的提出——菹草、红心鸭蛋与类胡萝卜素及人类健康的关系

2 深入开展菹草类胡萝卜素的基础和应用研究具有重大的理论和现实意义

3 本课题的研究目标和内容

第二章 菹草类胡萝卜素的分离纯化

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要化学试剂

1.3 实验仪器及设备

1.4 实验方法

1.4.1 菹草总类胡萝卜素提取条件的研究

1.4.1.1 浸提溶剂的选择

1.4.1.2 浸提条件的优选

1.4.1.2.1 浸提时间对菹草总类胡萝卜素浸提效果的影响

1.4.1.2.2 浸提次数对菹草总类胡萝卜素浸提效果的影响

1.4.1.2.3 浸提料液比对菹草总类胡萝卜素浸提效果的影响

1.4.1.2.4 浸提混合溶剂的比例对菹草总类胡萝卜素浸提效果的影响

1.4.1.2.5 菹草总类胡萝卜素浸提的正交试验

1.4.1.3 菹草总类胡萝卜素含量的测定

1.4.1.4 菹草类胡萝卜素提取率的测定

1.4.1.5 菹草水分含量的测定

1.4.2 菹草与红心鸭蛋类胡萝卜素特性的初步比较研究

1.4.2.1 菹草色素提取物的制备

1.4.2.2 菹草色素提取物的皂化

1.4.2.3 红心鸭蛋蛋黄总类胡萝卜素的提取

1.4.2.4 菹草与红心鸭蛋蛋黄总类胡萝卜素的薄层层析比较

1.4.2.5 菹草色素和总类胡萝卜素的溶解性、可见光谱和定性显色反应

1.4.3 菹草红色类胡萝卜素的柱层析和薄层层析分离、纯化和制备方法研究

2 结果与讨论

2.1 菹草总类胡萝卜素的提取条件

2.1.1 提取条件的单因素试验

2.1.1.1 溶剂对浸提效果的影响

2.1.1.2 浸提时间、次数、料液比和石油醚-丙酮混合比对菹草类胡萝卜素浸提效果的影响

2.1.2 菹草总类胡萝卜素提取的正交试验

2.1.3 菹草总类胡萝卜素的含量和提取率

2.2 菹草与红心鸭蛋蛋黄类胡萝卜素特性的初步比较研究

2.2.1 菹草色素提取物、菹草色素不皂化物及红心蛋色素的基本特性

2.2.2 菹草与红心鸭蛋蛋黄色素薄层层析条件的筛选和比较

2.2.3 菹草与红心鸭蛋蛋黄主要色素类型的初步鉴定

2.2.3.1 菹草和红心蛋蛋黄中的红色素

2.2.3.2 菹草和红心蛋中的黄色素

2.2.3.3 菹草色素中的绿色素和灰色素

2.2.4 菹草和红心鸭蛋与十几种天然动植物类胡萝卜素提取物的初步比较结果

2.3 菹草红色类胡萝卜素的柱层析-薄层层析分离、纯化和制备方法的建立

2.3.1 菹草红色类胡萝卜素柱层析分离和纯化条件

2.3.2 菹草红色类胡萝卜素薄层层析分离和纯化条件

3 本章小结

第三章 菹草红色类胡萝卜素的结构表征

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 主要化学试剂

1.3 实验仪器及设备

1.4 实验方法

1.4.1 菹草红色类胡萝卜素的分离纯化、制备及鉴定程序

1.4.2 菹草红色类胡萝卜素纯度的高效液相色谱(HPLC)检验

1.4.3 菹草红色类胡萝卜素的紫外可见光谱测定仪器和方法

1.4.4 类胡萝卜素的定性测试反应

1.4.5 菹草红色类胡萝卜素的红外光谱测定仪器和方法

1.4.6 菹草红色类胡萝卜素的拉曼光谱测定仪器和方法

1.4.7 菹草红色类胡萝卜素的质谱分析

1.4.7.1 高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析(HPLC-ESI-MS)

1.4.7.2 低分辨(LR)和高分辨(HR)电子轰击质谱分析(EI-MS)

1.4.8 菹草与紫杉浆果中红色类胡萝卜素——紫杉紫素的比较和验证

2 结果与分析

2.1 菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3分离纯化的薄层图谱

2.2 菹草红色类胡萝卜素r1、r2、r3纯度的高效液相色谱检验

2.3 菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的定性测试反应结果

2.4 菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的紫外可见吸收光谱特性

2.4.1 r1、r2和r3在不同有机溶剂中的紫外可见光谱

2.4.1.1 r1、r2和r3在正己烷中的紫外可见光谱

2.4.1.2 r1、r2和r3在丙酮中的紫外可见光谱

2.4.1.3 r1、r2和r3在乙醇中的紫外可见光谱

2.4.1.4 r1、r2和r3在甲醇中的紫外可见光谱

2.4.1.5 r1、r2和r3在氯仿中的紫外可见光谱

2.4.1.6 r1、r2和r3在二硫化碳中的紫外可见光谱

2.4.2 r1、r2和r3与虾青素、角黄素及β-胡萝卜素的紫外可见光谱特性比较

2.5 菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的红外光谱特性

2.6 菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的拉曼光谱特性

2.7 菹草红色类胡萝卜素r1、r2和r3的质谱特性

2.7.1 r1、r2和r3的高效液相色谱-电喷雾质谱特性

2.7.2 r1、r2和r3的低分辨和高分辨电子轰击质谱特性

2.8 菹草与紫杉浆果中红色类胡萝卜素——紫杉紫素的比较和验证

2.8.1 菹草与紫杉浆果中的紫杉紫素的薄层层析对照

2.8.2 紫杉浆果中分离纯化的紫杉紫素的紫外可见光谱及质谱特性

3 讨论

3.1 类胡萝卜素的光谱特性与结构鉴定

3.2 类胡萝卜素的结构鉴定需要多种分析手段综合完成，而质谱在结构鉴定中具有独特作用

4 本章小结

第四章 菹草类胡萝卜素抽提物(CEPC)对人肝癌细胞株QGY-7703生长抑制和凋亡的影响

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 主要试剂

1.3 仪器及设备

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

1.4.2 细胞生长抑制实验(MTT实验)

1.4.3 凋亡细胞形态的可见光显微镜观察

1.4.4 凋亡细胞形态的荧光显微镜观察

1.4.5 激光扫描共聚焦显微镜技术(Laser scanning confocal microscopy，LSCM)观察凋亡细胞形态

1.4.6 流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)检测CEPC对肝癌细胞QGY-7703凋亡的影响

1.4.7 激光扫描共聚焦显微镜技术测定CEPC对细胞浆中钙离子浓度的影响

1.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 CEPC对人肝癌细胞QGY-7703生长抑制的影响

2.2 CEPC对人肝癌细胞QGY-7703细胞株形态的影响

2.2.1 可见光显微镜观察CEPC对QGY-7703细胞形态的影响

2.2.2 荧光显微镜观察CEPC对QGY-7703细胞形态的影响

2.2.3 激光扫描共聚焦显微镜技术(LSCM)观察CEPC对QGY-7703细胞形态的影响

2.3 CEPC对人肝癌细胞QGY-7703凋亡指数的影响

2.4 CEPC对人肝癌细胞QGY-7703细胞周期的影响

2.5 CEPC对人肝癌细胞QGY-7703胞内游离Ca~(2-)浓度的影响

3 讨论

3.1 从天然生物材料中筛选活性成分来调控肿瘤细胞周期和细胞凋亡，是研究和开发抗肿瘤药物的发展战略和方向之一

3.2 细胞凋亡机制复杂，要采用多种技术方法综合加以研究

4 本章小结

第五章 菹草功能性红心蛋颗粒饲料的研制开发及蛋鸭喂养试验

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验设备及仪器

1.2.1 主要试验设备

1.2.2 主要分析仪器

1.3 试验内容和方法

1.3.1 菹草颗粒饲料的研制

1.3.1.1 鲜菹草的干燥试验

1.3.1.2 干菹草的粉碎和草粉造粒

1.3.1.3 菹草颗粒饲料的包装及贮藏试验

1.3.2 蛋鸭喂养试验

1.3.2.1 试验所用饲料

1.3.2.2 试验鸭分组及饲料配置

1.3.2.3 饲养管理要求

1.3.2.4 试验记录

1.3.3 检验指标和方法

1.3.3.1 菹草粉和菹草颗粒饲料的常规理化及营养成分测定

1.3.3.2 菹草粉和菹草颗粒饲料中的红色素的测定

1.3.3.2.1 硅胶G薄层板的制作

1.3.3.2.2 菹草饲料样品总脂溶性色素的提取

1.3.3.2.3 红色素的薄层分离和制备

1.3.3.2.4 比色测定及计算

1.3.3.3 菹草和红心蛋总类胡萝卜素含量采用分光光度法测定

1.3.3.4 菹草颗粒饲料与鲜菹草中脂溶性色素提取物的薄层层析比较

1.3.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 菹草颗粒饲料的试验结果

2.1.1 鲜菹革的干燥及菹草粉的造粒试验结果

2.1.2 菹草颗粒饲料的包装及贮藏试验结果

2.2 蛋鸭喂养试验结果

2.2.1 菹草颗粒饲料不同添加量对鸭蛋蛋黄色度的影响

2.2.2 菹草颗粒饲料不同添加量对鸭蛋平均蛋重的影响

2.2.3 菹草颗粒饲料不同添加量对蛋鸭产蛋率的影响

2.3 菹草粉和菹草颗粒饲料的理化及营养成分检测和评价

2.3.1 菹草粉与几种饲料的营养成分比较

2.3.2 菹草颗粒及红心蛋饲料营养成分检测结果

3 讨论

3.1 菹草颗粒饲料加工工艺流程及技术关键的探讨

3.2 红心蛋蛋黄色度与菹草颗粒饲料红色素含量关系的初步探讨

3.3 红心蛋饲料使用及蛋鸭饲养管理方面的技术要求

3.4 菹草颗粒饲料在红心鸭蛋生产中的经济效益初步分析

3.5 菹草颗粒饲料的功能特性的探讨

4 本章小结

第六章 结论

第七章 文献综述

综述一：菹草生物学特性、营养及经济价值研究开发现状

综述二：植物和天然食品材料中类胡萝卜素的分离、纯化和结构鉴定

参考文献

致谢

附录一 试验研究图表目录

附录二 有关的类胡萝卜素的结构式

附录三 查新报告

附录四 攻读博士学位期间发表的相关论文、成果及专利

发布时间: 2005-12-05

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