α-硫辛酸对山羊卵母细胞成熟质量与发育的影响

论文摘要

在动物胚胎工程技术研究和动物胚胎工程生产中，卵母细胞体外成熟培养是重要的一个技术环节。卵母细胞体外成熟培养工程中，氧化损伤是一个不可避免的问题，影响卵母细胞成熟效率和成熟质量，进而影响卵母细胞的有效利用。α-硫辛酸具有超强的抗氧化能力，被广泛应用于细胞培养和疾病治疗。本研究将α-硫辛酸添加进卵母细胞成熟培养液中，进行了最佳添加剂量筛选、α-硫辛酸对卵母细胞成熟率及成熟质量和孤雌激活胚胎发育的影响，主要研究结果如下：（1）在卵母细胞体外成熟液中添加500μM的LA时，近半数卵母细胞死亡，且卵母细胞质量明显下降，所以LA在卵母细胞体外成熟培养体系中对于卵母细胞的半数致死量为500μM。以500μM为LA添加的浓度上限浓度向下逐级递减，统计卵母细胞体外成熟率及其孤雌激活胚胎发育率，添加25μMLA时卵母细胞体外成熟率最高且孤雌激活胚胎发育较好，所以，25μM为LA在卵母细胞体外成熟培养体系中的最佳添加浓度。（2）在卵母细胞体外成熟液中添加25μMLA成熟卵母细胞，卵母细胞的体外成熟率显著高于未添加组（67.5%vs59.66%）（P<0.05）。而且孤雌激活胚胎的囊胚率也显著高于未添加组（23.51%vs18.8%）（P<0.05）。虽然两组间的早期卵裂率没有显著差异（P>0.05），LA添加组的早期胚胎质量显著优于未添加组。根据对孤雌激活囊胚的CDX2染色发现，LA添加组的孤雌囊胚内细胞团所占比例显著高于未添加组（30.87%vs27.81%）（P<0.05）。所以，添加25μMLA成熟卵母细胞有助于提高卵母细胞成熟率和孤雌激活胚胎的发育率及发育质量。（3）添加25μMLA LA成熟卵母细胞并经过孤雌激活发育至囊胚。根据囊胚TUNEL凋亡染色结果发现，LA添加组第八天囊胚的细胞凋亡率显著低于未添加组（2.51%vs3.68%）。以β-actin为内参基因对孤雌激活囊胚中凋亡基因Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-8、CytC和抗凋亡基因Bcl-2进行定量检测，结果显示LA添加组中凋亡基因Bax、Bad、Caspase-3、CytC的表达量显著低于未添加组（P<0.05），但抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Caspase-8表达量差异不显著（P>0.05）。（4）添加25μMLALA成熟卵母细胞并经过孤雌激活发育至囊胚，LA添加组中成熟卵母细胞胞质中的GSH含量极显著地高于未添加组（9.3pmol/oocyte vs5.83pmol/oocyte）（P<0.01）。但是两组之间孤雌激活囊胚胞质GSH含量差异不显著（P>0.05）。在两组中孤雌激活囊胚胞质的GSH含量都显著低于同组的成熟卵母细胞胞质中GSH的含量（P<0.05）。以β-actin为内参基因对成熟卵母细胞和孤雌激活囊胚中SOD和GPX4进行定量检测， LA添加组成熟卵母细胞胞质中SOD的表达量显著高于未添加组（P<0.05），但在孤雌激活囊胚中两组间SOD表达量差异不显著（P>0.05）。LA添加组成熟卵母细胞胞质中GPX4的表达量差异极显著地高于未添加组（P<0.01），在孤雌激活囊胚中LA添加组的GPX4表达量也显著高于未添加组（P<0.05）。本论文进行的相关研究为将α-硫辛酸在卵母细胞体外成熟过程的应用提供了参考，同时优化了卵母细胞成熟体系。对提高卵母细胞体外成熟率及成熟质量有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 卵母细胞体外成熟研究进展
• 1.1 卵母细胞成熟机制和卵母细胞体外成熟质量判定标准
• 1.1.1 卵母细胞成熟机制
• 1.1.2 卵母细胞体外成熟质量判定
• 1.2 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 1.2.1 卵母细胞的来源和自身质量对卵母细胞体外成熟的影响
• 1.2.2 体外成熟操作及培养条件对卵母细胞体外成熟的影响
• 第二章 细胞凋亡研究进展
• 2.1 细胞凋亡的形态学和生化特性的研究进展
• 2.1.1 细胞凋亡的形态学变化
• 2.1.2 细胞凋亡的发生的生化特性改变
• 2.1.3 细胞凋亡、细胞坏死及细胞程序化死亡
• 2.2 细胞凋亡的调控机制的研究进展
• 2.2.1 细胞凋亡的一般过程
• 2.2.2 主要的细胞凋亡及抗凋亡调控基因
• 2.3 细胞凋亡信号转导通路
• 2.3.1 细胞凋亡的膜受体通路
• 2.3.2 细胞凋亡的线粒体通路
• 2.4 卵母细胞和早期胚胎的凋亡
• 2.5 细胞凋亡的检测方法
• 2.5.1 形态学检测
• 2.5.2 分子生物学检查
• 2.5.3 流式细胞仪检测法
• 第三章 细胞氧化损伤研究进展
• 3.1 细胞氧化损伤原理与机体抗氧化机制
• 3.1.1 细胞氧化损伤的原理
• 3.1.2 机体抗氧化损伤机制及氧化损伤的修复
• 3.3 卵母细胞和胚胎氧化损伤的相关研究
• 3.4 α-硫辛酸研究进展
• 3.4.1 α-硫辛酸的理化、生化特征
• 3.4.2 α-硫辛酸作的抗氧化机理
• 3.4.3 α-硫辛酸的其他生物学功能
• 第四章 卵母细胞体外成熟中α-硫辛酸添加浓度的筛选
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 仪器与设备
• 4.1.3 材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 山羊卵母细胞采集
• 4.2.2 山羊卵母细胞体外成熟
• 4.2.3 山羊卵母细胞成熟率观察
• 4.2.4 卵母细胞的孤雌激活与孤雌激活胚胎体外培养
• 4.2.5 试验设计与分组
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 OM 中添加α-硫辛酸的半数致死量的确定
• 4.3.2 OM 中添加α-硫辛酸的最佳浓度的确定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对卵母细胞和孤雌激活胚胎发育的影响
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器与设备
• 5.1.3 材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 山羊卵母细胞采集
• 5.2.2 山羊卵母细胞体外成熟
• 5.2.3 山羊卵母细胞成熟率观察
• 5.2.4 卵母细胞的孤雌激活与孤雌激活胚胎体外培养
• 5.2.5 孤雌激活胚胎早期发育观察
• 5.2.6 囊胚的内细胞团差异染色
• 5.2.7 试验设计与分组
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 添加α-硫辛酸对卵母细胞成熟的影响
• 5.3.2 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对孤雌激活胚胎发育率的影响
• 5.3.3 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对孤雌激活胚胎囊胚细胞数和内细胞团细胞数的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对孤雌激活囊胚细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响
• 6.1 材料与试剂
• 6.1.1 试剂
• 6.1.2 仪器与设备
• 6.1.3 材料
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 山羊卵母细胞采集
• 6.2.2 山羊卵母细胞体外成熟
• 6.2.3 卵母细胞的孤雌激活与孤雌激活胚胎体外培养
• 6.2.4 囊胚的 TUNEL 凋亡染色
• 6.2.5 囊胚的总 mRNA 提取与反转录
• 6.2.6 凋亡基因的荧光定量检测
• 6.2.7 试验设计与分组
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对孤雌激活囊胚细胞凋亡率的影响
• 6.3.2 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对孤雌激活囊胚中 Bad、Bcl-2、Bax 基因表达的影响
• 6.3.3 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对孤雌激活囊胚中 Caspase 相关基因表达的影响
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对于卵母细胞和孤雌激活囊胚抗氧化能力的影响
• 7.1 材料与试剂
• 7.1.1 试剂
• 7.1.2 仪器与设备
• 7.1.3 材料
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 山羊卵母细胞采集
• 7.2.2 山羊卵母细胞体外成熟
• 7.2.3 卵母细胞的孤雌激活与孤雌激活胚胎体外培养
• 7.2.4 成熟卵母细胞和囊胚中谷胱甘肽（GSH）含量的测定
• 7.2.5 囊胚的总 mRNA 提取与反转录
• 7.2.6 成熟卵母细胞的 mRNA 提取与反转录
• 7.2.7 抗氧化基因的荧光定量检测
• 7.2.8 试验设计与分组
• 7.3 实验结果
• 7.3.1 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对卵母细胞和孤雌激活囊胚细胞质中谷胱甘肽（GSH）含量的影响
• 7.3.2 添加α-硫辛酸成熟卵母细胞对卵母细胞及孤雌激活囊胚中抗氧化基因的影响
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 作者简介