论文摘要
目的帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,其典型的神经病理形态学特征为中脑黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元进行性变性缺失和变性神经元胞浆内出现嗜酸性包涵体——Lewy体。α-突触核蛋白(α-synuclein)是Lewy体的主要组成成分。目前PD确切的发病原因和机制尚未明了,但普遍倾向于认为是基因与环境因素共同作用的结果。近来有研究表明,DJ-1基因突变与某些家族遗传性PD发生相关;而在部分散发性PD患者,也发现了DJ-1基因突变。DJ-1蛋白还被多次报道具有调节转录,抗氧化应激及分子伴侣等功能活性;而氧化应激引起的线粒体损伤,某些蛋白的异常聚集等过程都很可能是引起PD发病的关键步骤。这说明,DJ-1很可能与PD发病有密切关系,即DJ-1基因的功能缺失性突变可能与DA能神经元的变性缺失有关,而具有正常抗氧化应激功能及分子伴侣活性的DJ-1可能在PD发病的过程中起到一定的保护作用,但对其作用机制的认识仍不清楚。本实验拟克隆人的DJ-1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1-DJ-1,用后者来转染人多巴胺能神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,建立转人野生型DJ-1基因的工程细胞模型,以便今后深入探讨DJ-1的功能作用及其与PD发病之间的关系,从而有效指导针对PD的基因治疗。方法本研究从中国人流产胚胎的肝组织中提取总RNA,并逆转录成cDNA,根据GeneBank已发表的DJ-1 cDNA序列设计一对特异引物,用PCR方法扩增目的cDNA片段,将扩增产物连入pGEM T-easy载体,经限制性内切酶HindⅢ和XbaI双酶切连接产物初步鉴定插入片段后,进行全序列测定。待测序结果证明无误,将DJ-1亚克隆入pcDNA3.1,再次用限制性内切酶HindⅢ和XbaI对重组质粒pcDNA3.1-DJ-1进行酶切鉴定。为鉴定重组质粒pcDNA3.1-DJ-1是否可在真核细胞中表达,本研究用pcDNA3.1-DJ-1载体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,建立转人野生型DJ-1基因的细胞模型,同时用未转基因的SH-SY5Y细胞作为阴性对照组。本研究通过LipofectAMINE的方法对SH-SY5Y细胞进行基因转染。对转染后的细胞用RT-PCR,Western Blot等方法检测转染效果。并用MTT法对转基因细胞的生长曲线进行了测定。结果RT-PCR法扩增目的片段后,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到1条符合预期片段大小的特异性片段,即636bp。将扩增产物连入pGEM T-easy载体,重组质粒pGEM T-DJ-1测序分析,结果与GeneBank登录的DJ-1 cDNA全序列完全相同,证明PCR产物为所需目的片段DJ-1 cDNA。将该目的片段亚克隆入pcDNA3.1后,酶切重组质粒,电泳结果符合预期片段大小。结果证明pcDNA3.1-DJ-1真核表达载体构建成功。将重组质粒pcDNA3.1-DJ-1转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,检测其在SH-SY5Y细胞中的表达情况。RT-PCR检测结果显示:转基因细胞组,RT-PCR扩增后电泳结果显示得到了与预期大小相符的DJ-1片段,即636bp的片段。未转基因细胞没有得到上述片段。Western Blot检测结果显示转基因细胞组及未转基因细胞均在20kD处可见一条明显的条带,但前者的表达量要明显高于后者。此后,用MTT法对转基因细胞的生长曲线及未转基因细胞的生长曲线均进行了测定,结果显示:转基因细胞及未转基因细胞的生长状态都良好,且细胞活性并无明显差别。结论成功克隆出中国人的DJ-1基因;成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-DJ-1并且能够在SH-SY5Y细胞中表达。
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