灭活溶藻弧菌适配子的SELEX筛选及其应用研究

论文摘要

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）分布广,数量多,发病率高,是水产养殖中常见的条件致病菌,因此,对溶藻弧菌进行快速检测是其病害防治的前提和基础。适配子,因为具有较高的亲和特异性,在微生物的快速检测方面展现出了巨大的优势。本文以灭活的溶藻弧菌（V.alginolyticus）为靶目标进行SELEX筛选,经过15轮的筛选,筛选文库的亲和力从第一轮的0.025上升至第15轮的0.452,升高了18倍,并对灭活溶藻弧菌呈现出较好的亲和特异性,相应的亲和常数Kd=27.5±9.2 n M。最后一轮的筛选产物经克隆、测序后,获得了32个不同的适配子序列,其中有6个适配子（#4、#7、#8、#9、#14、#23）为高频适配子,在测序结果中出现2次以上,经亲和特异性研究发现这6个适配子对灭活溶藻弧菌都具有较好的亲和特异性,相应的亲和常数分别为7.14±2.73 n M、28.39±11.46 n M、12.82±6.00 n M、15.21±4.60 n M、14.65±4.90 n M、46.89±15.87 n M。对32个适配子序列进行一级结构分析显示,这些适配子可分为9个家族,其中第1至第6家族的同源性均在80%以上,并在第1至第8家族均有发现保守序列,而对适配子的二级结构分析发现,P（1+1）型适配子数量最多,推测该类型的适配子可能具有较好的扩增性。利用PCR产物和适配子对溶藻弧菌样品进行了定性检测,结果显示,PCR产物最低能检测到102个/ml灭活溶藻弧菌和103个/ml活的溶藻弧菌,而适配子最低能检测到10个/ml灭活溶藻弧菌或活的溶藻弧菌;对于血清中的溶藻弧菌,适配子也显示出了较好的检测效果。最终建立了以适配子和PCR技术为基础的、针对溶藻弧菌的定性检测技术。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号表
• 第1章 引言
• 1.1 溶藻弧菌生物学特性
• 1.2 溶藻弧菌致病症状
• 1.3 溶藻弧菌的致病因子
• 1.3.1 粘附素
• 1.3.2 胞外产物
• 1.3.3 脂多糖
• 1.3.4 摄铁系统
• 1.3.5 外膜蛋白
• 1.4 溶藻弧菌主要检测方法
• 1.4.1 生理生化鉴定法
• 1.4.2 单克隆抗体法
• 1.4.3 ELISA法
• 1.4.4 PCR法
• 1.4.5 LAMP法
• 1.5 SELEX技术简介
• 1.5.1 SELEX技术的原理
• 1.5.2 SELEX技术的基本流程
• 1.5.3 适配子特点
• 1.5.4 SELEX技术的发展
• 1.5.5 SELEX技术的应用
• 1.6 本论文的研究意义
• 第2章 灭活溶藻弧菌特异性适配子的SELEX筛选
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 SELEX筛选效果
• 2.2.2 ssDNA富集库的亲和力变化
• 2.2.3 ssDNA富集库亲和特异性验证及其亲和常数的测定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 ssDNA文库的扩增
• 2.3.2 SELEX筛选中PCR条件的优化
• 2.3.3 SELEX筛选中分离方法的选择
• 2.3.4 SELEX筛选的策略
• 2.3.5 亲和力的测定方法
• 2.4 小结
• 第3章 适配子的克隆测序及分析验证
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 序列的一级结构分析
• 3.2.2 适配子的二级结构分析
• 3.2.3 6 条高频适配子的亲和特异性
• 3.3 讨论
• 3.3.1 适配子的中间序列长度
• 3.3.2 适配子的二级结构分析
• 3.3.3 高频适配子的研究价值
• 3.4 小结
• 第4章 适配子应用研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 市售弧菌检测试剂盒对溶藻弧菌的检测方法
• 4.1.3 适配子对溶藻弧菌的定性检测
• 4.1.4 利用适配子对血清中的溶藻弧菌进行定性检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 市售弧菌试剂盒对弧菌的定性检测
• 4.2.2 第15轮PCR产物对灭活溶藻弧菌的定性检测
• 4.2.3 适配子对溶藻弧菌的定性检测
• 4.2.4 适配子对血清中溶藻弧菌的定性检测
• 4.3 讨论
• 4.3.1 目前市售溶藻弧菌检测试剂盒存在的问题
• 4.3.2 适配子在溶藻弧菌检测中的应用效果
• 4.3.3 PCR产物在检测中的应用价值
• 4.4 小结
• 第5章 结论和展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文