紫苏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及序列分析

论文摘要

本研究以紫苏嫩叶cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends, RACE）技术,首次从紫苏中克隆到迷迭香酸生物合成途径上的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL）基因（命名为Per PAL）全长cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析和表达谱研究。通过对已报道的唇形科植物丹参、藿香等的PAL基因保守序列进行比对,设计引物,采用RACE的方法克隆到2458bp的cDNA全长,包含2136bp的开放阅读框（ORF）,编码712个氨基酸,96bp的5’非编码区（5’UTR）和226bp的3’非编码区（3’UTR）。 BLAST比对显示该基因与已报道的PAL基因具有很高的相似性,其核苷酸序列与丹参的相似度达90%,与藿香、黄芪的分别达85%和82%,氨基酸序列与丹参、藿香的相似度为88.69%,说明已成功克隆到PerPAL基因。用生物信息学软件对所克隆的紫苏PerPAL基因进行序列分析,结果表明：其编码的氨基酸的亲水性分析表现为亲水性；信号肽研究结果表明其不存在信号肽酶切位点,不具有信号肽。同时,跨膜结构域预测结果显示其不具有跨膜结构域。对紫苏PAL蛋白前体的二级结构预测显示,其含有45.57%的α螺旋、11.11%的延伸链和43.32%的随机卷曲；进一步对其高级结构进行预测,得到了PerPAL蛋白的三维模型。PAL系统进化树分析结果表明,各PAL编码的蛋白均有明显的种属特性,PerPAL与唇形科植物的PAL亲缘关系最近,且PAL基因早在被子植物和裸子植物中就已经存在,是一个古老的基因。以紫苏β-Actin基因作内标,采用RT-PCR法分析PerPAL-1基因在根、茎、叶的相对表达量,结果表明PerPAL-1基因在叶中的表达丰度最高,茎中最低,推断PAL在紫苏各组织中的表达可能与迷迭香酸的合成成正相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 紫苏
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 分布
• 1.1.3 成分
• 1.1.4 紫苏的生物活性
• 1.2 迷迭香酸
• 1.2.1 结构
• 1.2.2 分布
• 1.2.3 迷迭香酸的生物活性
• 1.2.4 迷迭香酸的合成
• 1.3 PAL
• 1.3.1 PAL的存在与分布
• 1.3.2 PAL酶学性质
• 1.3.3 PAL的植物生理学作用
• 1.3.4 PAL基因的克隆与表达
• 1.3.5 PAL的研究展望
• 1.4 RACE技术
• 1.4.1 RACE的原理
• 1.4.2 RACE的局限性
• 1.4.3 RACE的技术改进
• 1.4.4 RACE技术在植物基因研究中的应用
• 1.4.5 RACE在植物基因研究上的发展前景
• 1.5 本课题的研究目的及意义
• 1.6 本论文研究的内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 紫苏真叶总RNA的提取及检测
• 2.4.2 cDNA第一链合成
• 2.4.3 同源序列比对及中间片段引物的设计合成
• 2.4.4 紫苏目的基因片段的克隆
• 2.4.5 目的基因片段的测序
• 2.4.6 紫苏PAL基因5'端cDNA的克隆
• 2.4.7 紫苏PAL基因3'端cDNA的克隆
• 2.4.8 目的基因的生物信息学分析
• 2.4.9 PerPAL-1基因的组织表达谱研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 紫苏真叶中总RNA的提取
• 3.2 PAL基因片段的克隆
• 3.2.1 PerPAL-1的克隆
• 3.2.2 PerPAL-2的克隆
• 3.2.4 PerPAL-3的克隆
• 3.2.5 PerPAL-4的克隆
• 3.3 片段测序结果及拼接
• 3.4 PerPAL 5’端及3’端cDNA的克隆
• 3.4.1 PerPAL 5’端cDNA的克隆
• 3.4.2 PerPAL 3’端cDNA的克隆
• 3.5 PerPAL基因序列全长
• 3.6 紫苏PAL的生物信息学分析
• 3.6.1 PerPAL疏水性分析
• 3.6.2 PerPAL二维结构模型分析
• 3.6.3 PerPAL信号肽分析
• 3.6.4 PerPAL跨膜结构域分析
• 3.6.5 PerPAL三维结构模型
• 3.7 PerPAL进化树分析
• 3.8 PerPAL-1基因的组织表达谱分析
• 3.8.1 β-Actin PCR反应条件的优化
• 3.8.2 PerPAL-1基因在根、茎、叶中相对表达量分析
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢
• 附录