毕赤酵母AOX1启动子葡萄糖阻遏相关基因PpHXS1及甲醇诱导相关基因PpMPP1、PpTRM1的鉴定

论文摘要

毕赤酵母表达系统被广泛应用于表达异源蛋白,其中最常用来驱动异源蛋白表达的是AOXl启动子。AOXl启动子受到葡萄糖的抑制和甲醇的高效诱导。本研究工作主要进行了毕赤酵母AOXl启动子葡萄糖脱阻遏突变株的筛选,并鉴定了突变株的突变基因PpHXS1,以及鉴定了AOXl启动子甲醇诱导相关基因PpMPPl和PpTRMl.本文首先利用在甲醇碳源中添加葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖的方法,筛选得到葡萄糖脱阻遏随机突变株BN8。利用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告蛋白,BN8突变株在葡萄糖、果糖、甘露糖中均具有AOX1启动子活性,但是在甘油中仍然没有AOXl启动子活性。利用毕赤酵母基因组数据库,对BN8突变株基因组中的一些预测开放阅读框进行DNA测序分析,确定BN8中和酿酒酵母己糖感应体Snf3/Rgt2有很高相似性的一个基因（locustag="PASchrl-10300"; Gene ID:8197942）的编码区发生移码突变（第1144位T碱基丢失）。将该预测基因命名为PpHXS1。通过把PpHXS1基因回补到BN8突变株的实验,我们确认BN8的表型是由于PpHXS1突变引起的。通过分析PpHXS1基因敲除菌株,确认PpHXS1基因在AOXl启动子的葡萄糖抑制上起了重要作用。通过生物信息学分析,PpHXS1基因是一个具有十二跨膜结构的己糖感应体。它对己糖利用起着非常关键的作用,该基因的突变使菌株在葡萄糖中的生长明显受损,并且不能在添加呼吸链抑制剂抗霉素A的葡萄糖碳源中生长。同时我们发现PpHXS1基因突变对葡萄糖引起的过氧化物酶体自噬没有明显影响。通过在毕赤酵母数据库中进行BLAST比对,在毕赤酵母中找到汉逊酵母Mpplp和博伊丁假丝酵母Trmlp的同源蛋白编码基因PpMPP1 （locustag= "PASchr30836"; Gene ID:8200325）、PpTRMl （locustag= "PASchr40203"; Gene ID:8201109）。这两个基因编码的蛋白在氨基酸链的N端均具有转录因子所具有的典型的锌指结构。通过分析PpMPP1基因和PpTRM1基因的缺失株,确认PpMpp1、PpTrm1调节毕赤酵母AOXl启动子的甲醇诱导。PpMPP1或PpTRM1基因缺失后,菌株不能甲醇碳源中生长，,Aox酶的表达和AOXl启动子的活性都降至极低的水平。本课题获得的BN8突变株在葡萄糖碳源下AOX1启动子的活性可以达到野生型甲醇诱导下AOXl启动子活性的1/3。但要进一步提高表达量,仍然需要甲醇的诱导。我们鉴定的AOXl启动子的甲醇诱导调节因子PpMpp1和PpTrm1,对寻找人工激活甲醇诱导途径的方法以进一步提高BN8突变株葡萄糖诱导下AOX1启动子的活性,具有重要的理论指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 毕赤酵母表达系统
• 1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展
• 1.1.2 甲基营养性酵母的甲醇利用途径
• 1.1.3 毕赤酵母AOX1启动子简介
• 1.2 毕赤酵母中被用来表达异源蛋白的启动子
• 1.3 酵母中与碳源阻遏相关的基因
• 1.4 酿酒酵母葡萄糖感受体基因SNF3和RGT2
• 1.5 汉逊酵母GCR1、HXS1和毕赤酵母HXT1基因
• 1.6 甲基营养型酵母的甲醇诱导相关调节因子
• 1.7 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统的主要问题
• 1.8 利用葡萄糖生产异源蛋白的优点
• 1.9 本课题的研究背景及意义
• 第2章 毕赤酵母Aox酶葡萄糖脱阻遏突变菌株的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 培养基和培养条件
• 2.2.3 生物化学或分子生物学试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 平板显色检测Aox酶表达
• 2.3.2 筛选突变株步骤
• 2.3.3 毕赤酵母总蛋白的提取
• 2.3.4 Aox酶活测定
• 2.3.5 感受态毕赤酵母制备及电穿孔转化
• 2.3.6 毕赤酵母基因组的抽提
• 2.3.7 蓝色荧光标记过氧化物酶体菌株的构建
• 2.3.8 毕赤酵母GFP表达菌株构建
• 2.3.9 毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选
• 2.3.10 流式细胞仪检测GFP表达量
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 葡萄糖脱阻遏突变株的筛选
• 2.4.2 BN8突变株在各种碳源中的Aox酶表达
• 2.4.3 葡萄糖、果糖和甘露糖诱导Aox表达发生在转录水平
• AOX1)驱动下绿色荧光蛋白（GFP）的表达'>2.4.4 BN8突变株AOX1启动子(P_AOX1)驱动下绿色荧光蛋白（GFP）的表达
• 2.4.5 BN8突变株在葡萄糖、甘油和甲醇中的生长特性
• 2.5 小结
• 第3章 AOXl启动子葡萄糖脱阻遏突变株BN8受损基因的鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 毕赤酵母中葡萄糖抑制相关基因同源基因的搜索
• 3.3.2 BN8突变株的各种基因的测序
• 3.3.3 Δhxs1菌株的构建
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 BN8突变基因的测序
• 3.4.2 BN8突变株PpHXS1基因回补实验
• 3.4.3 毕赤酵母HXS1基因缺失株Δhxs1的构建
• 3.4.4 Δhxs1菌株在添加2-脱氧葡萄糖的甲醇碳源中的生长
• 3.4.5 Ahxs1菌株在各种碳源中的Aox酶的表达
• 3.4.6 PpHXS1基因序列的生物信息学分析
• 3.4.7 PpHxs1突变对过氧化物酶体自噬产生的影响
• 3.5 小结
• 第4章 ΔPphxt1ΔPpmpp1、ΔPpmpp1和ΔPptrm1菌株的构建
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 汉逊酵母MPPl同源基因的搜索
• 4.4.2 博伊丁假丝酵母Trm1p类似基因的搜索
• 4.4.3 毕赤酵母Δmpp1菌株的构建
• 4.4.4 毕赤酵母Δtrm1菌株的构建
• 4.5 小结
• 第5章 PpMPP1和PpTRM1的功能鉴定
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料和方法
• 5.2.1 毕赤酵母总RNA的提取
• 5.2.2 反转录PCR制备cDNA
• 5.2.3 实时定量PCR测定基因PpMPP1和PpTRMl的转录水平
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 Δhxt1ΔAmpp1、Δmpp1菌株Aox酶的表达
• 5.3.2 Δmpp1、Δhxt1Δmpp1菌株中AOX1启动子驱动下GFP的表达
• 5.3.3 Δtrm1菌株Aox酶的表达
• 5.3.4 Δtrm1菌株中AOX1启动子驱动下GFP的表达
• 5.3.5 PpTRM1和PpMPP1在甲醇和葡萄糖碳源中的转录
• 5.4 小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 论文发表
• 致谢