利用亲和素磁珠法开发毛竹SSR引物

论文摘要

微卫星或简单重复序列（simple sequence repeats, SSR）近年来发展起来的一种新的DNA分子标记,因其具有保守性、高多态性、共显性等特点,是毛竹（Phylbstachys pubescens）基因组研究不可或缺的一种重要工具。磁珠富集法是一种快速、高效分离微卫星分子标记的方法。本研究在参考其它文献报道的基础上,通过优化亲和素磁珠技术构建毛竹基因组SSR位点富集文库。在文库构建过程中,用EcoRⅠ分别和DraⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、PvuⅡ四种平端限制性内切酶对毛竹基因组DNA进行双酶切,酶切片段回收后与根据抑制性PCR原理设计的接头连接。在利用亲和素磁珠富集含有SSR序列的DNA片段过程中,对杂交、漂洗及洗脱步骤进行优化。回收产物经PCR扩增及转化后,得到约2000个克隆。通过三引物特异PCR筛选,得到约300个含有SSR位点的阳性克隆,文库的阳性克隆率为19%左右,依据阳性克隆率并结合测序结果对富集SSR文库进行评价,确定了一条简单、经济、高效分离竹类植物SSR标记的方法。对其中150个阳性克隆进行测序并分析,AG重复占到96.3%,AC重复占到4.7%。将其中62个SSR重复次数大于8次,并且位置居中的序列提交到GenBank并将其进行归类。其中复合型的微卫星共9个占16.3%,完美型的35个占56.3%,非完美型的27个占43.7%。SSR重复数在10次以下的为11个,重复10-20次的为37个,重复20次以上的为14个。根据序列设计SSR特异扩增引物,并以刚竹属（Phyllostachys）、唐竹属（Sinobambusa）、刺竹属（Bambusa）、青篱竹属（Pseudosasa）的8个竹种DNA为模板,通过PCR检测筛选出11对多态性较好的引物,为进一步开发毛竹SSR引物及对竹类植物生物多样性研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第1章 文献综述
• 1.1 遗传标记
• 1.2 DNA分子标记
• 1.2.1 基于Southern杂交技术的分子标记
• 1.2.2 基于PCR技术的分子标记
• 1.2.3 基于PCR与限制性酶切技术相结合的DNA标记
• 1.2.4 基于单核苷酸多态性的DNA标记
• 1.3 微卫星DNA简述
• 1.3.1 微卫星由来及应用
• 1.3.2 SSR标记的产生机理及其作为分子标记的优点
• 1.3.3 微卫星序列在植物基因组中的丰度与多态性
• 1.3.4 SSR分子标记的开发
• 1.4 竹类遗传标记的研究进展
• 第2章 亲和素磁珠法分离毛竹SSR标记开发程序
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 菌株、质粒、培养基与主要试剂、仪器
• 2.2 主要实验程序
• 2.2.1 毛竹DNA的提取
• 2.2.2 模板DNA浓度的检测
• 2.2.3 接头及引物的设计与处理
• 2.2.4 基因组DNA的酶切及与接头连接
• 2.2.5 磁珠富集含有SSR位点的片段
• 2.2.6 富积文库的构建
• 2.2.7 含SSR序列克隆PCR筛选、测序
• 2.2.8 SSR位点序列分析和SSR引物设计
• 2.2.9 SSR引物筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 毛竹基因组提取、酶切、与预扩增
• 2.3.2 文库评价
• 2.3.3 洗脱条件确定
• 2.3.4 阳性克隆筛选
• 2.3.5 测序结果
• 2.3.6 微卫星特征分析
• 2.3.7 SSR引物筛选结果
• 2.4 讨论
• 第3章 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢