论文摘要
目的：在我国乙型肝炎病毒（HBV）相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发病率、死亡率均排名于疾病谱前列,严重危害人民健康,目前尚无满意的治疗方法。为此寻找新的抗HBV治疗方法成为当前急需解决的重要问题。近年发现的microRNA （miRNA）,是一种广泛存在于真核生物中、大小约18-25个核苷酸（nt）的内源性单链小分子RNA,参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。越来越多的研究表明,miRNA也能够调控RNA和DNA病毒的复制。那么,miRNA是否也参与了HBV的复制呢?为此,我们首次研究了靶定于HBV基因组和宿主细胞基因组的人类的miRNA,为研究HBV和miRNA之间的相互作用及其机制奠定初步的实验依据,为今后抗HBV增殖药物的开发提供新的手段和分子基础。方法：1.分别用328种miRNA的反义链转染HepG22.2.15细胞,72小时收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平2.将筛选到的对表面抗原产生有抑制作用和促进作用的miRNA的反义链梯度转染HepG22.2.15细胞,72小时收获上清,实时定量PCR检测其中HBV的拷贝数,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平。3.用miRanda, TargetScan, PicTar, miRDB和ViTa五个网站预测筛选miRNA在HBV基因组上的靶基因,对于在HBV基因组上没有靶位点的miRNA,网站预测的结果联合mRNA表达谱芯片和RT-PCR技术,对其靶基因做进一步预测。4.分别构建筛选到的miRNA的过表达载体,包含靶位点的EGFP报告载体和靶位点突变的EGFP报告载体。并且分别在HEK293和HepG22.2.15细胞中进行荧光报告载体实验验证候选的靶基因。结果：1.MTS和ELISA的结果显示,在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p, miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的表达,而miR-370促进了病毒表面抗原的表达。2.实时定量PCR的结果显示,miR-199a-3p, miR-210和miR-185抑制了HBV的复制,这种抑制作用具有剂量依赖性。3.网站预测了miR-199a-3p, miR-210, miR-185和miR-370的靶基因,miR-199a-3p, miR-210分别靶定于HBV的表面抗原和表面抗原的启动子2。而在HBV上没有发现miR-185和miR-370的靶位点,通过mRNA表达谱芯片结合生物信息学的方法,我们筛选到miR-185可能的靶基因有PRKCH,ATP5B和NR1D1, miR-370可能的靶基因有FUS和TPM4。并且通过RT-PCR和芯片验证,PRKCH, ATP5B的RT-PCR结果和芯片结果相符。4.在HEK293和HepG22.2.15两种细胞中,利用荧光报告载体实验验证了miR-199a-3p, miR-210和miR-185与候选基因的直接作用关系,结果显示,miR-199a-3p, miR-210, miR-185分别通过靶定HBsAg, HBSP2和PRKCH,从而抑制了HBV表面抗原的产生以及HBV的复制。结论：本研究首次发现了通过直接靶定HBV基因组或者宿主细胞基因,从而抑制病毒表面抗原产生和病毒复制的hsa-miRNA。miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子（激活因子或抑制因子）,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。该研究对于阐明细胞miRNA和HBV之间错综复杂的相互作用提供了依据,对于我们理解宿主和病原体之间内在的相互调控提供很大的帮助,可能为解释病毒的组织嗜性,潜伏感染,和癌原性提供新的理论依据,而且,病毒感染相关miRNA的研究有望成为抗病毒治疗新的重要靶点。