论文摘要
脓毒症是各种严重创伤、感染、缺血再灌注损伤及外科大手术常见的并发症,至今在临床上仍缺乏有效的治疗手段,由严重脓毒症和脓毒症性休克导致的病死率高达30%左右。脓毒症具有患病率高、死亡率高、治疗费用高的“三高”现象,临床上脓毒症大多数由革兰氏阴性（G-）细菌感染所致。内毒素（Endotoxin）又称脂多糖（lipoplysacchride, LPS）是G-细菌细胞壁上的主要成分和主要的致病成分,其具有广泛的生物活性,通过引起炎症细胞释放TNF-α等大量炎症介质,导致全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）及多器官功能障碍。内毒素耐受（endotoxin tolerance,ET）是指预先以小剂量LPS或其同系物刺激动物或单核-巨噬细胞系统（Mononuclear phagacytic system,MPS）随后再用致死剂量的LPS攻击时,表现为对LPS的低反应性,以保护机体免受LPS致死性毒性反应的现象,称内毒素耐受。内毒素耐受被认为是生物在长期进化过程中形成的一种负反馈调节机制,是一种主动性适应性应答,总体来说内毒素耐受时的细胞因子低表达对机体的影响是积极的。目前,关于内毒素耐受及形成机制仍未完全阐明。NF-κB是一个多功能核转录因子,在调控促炎症基因的合成和释放中起决定性作用,其过度活化并启动相关靶基因转录,可产生和释放大量炎性介质,从而引起“介质病”。在基础情况下,NF-κB二聚体被NF-κB抑制蛋白（inhibitors of NF-κB,IκB）隐没于细胞质中。因此,NF-κB活化的前提条件是IκB的降解或去除NF-κB母核的抑制区域。激活的NF-κB复合物转入细胞核内,与靶基因启动子结合后行使其转录调节功能。目前大量的研究证据表明:细胞中存在着NF-κB激活的负性调节通路,即在NF-κB激活的同时,也进行着NF-κB负性调节因子的的合成及再合成。该负性调节通路的存在能够限制和阻断前炎症因子诱导的NF-κB的活性,以限制炎症性损伤是至关重要的。最近研究发现,扭蛋白Twist-2是核转录因子NF-κB的负性调节的重要相关蛋白,它在参与负性NF-κB调节通路及减缓炎症的应答中起到重要的作用,从而有可能参与内毒素耐受的形成机制。本研究即通过内毒素预处理建立内毒素耐受小鼠模型及体外Kupffer细胞模型,观察在内毒毒耐受状态下机体及细胞中Twist-2表达的变化,初步确定Twist-2与内毒素耐受的关系;进而采用特异性RNA干扰技术在体外沉寂Twist-2的基因表达,观察Kupffer细胞内毒素耐受性的改变;由此阐明Twist-2在内毒素耐受形成中的作用及机制,从而为脓毒症的临床治疗提供新的干预靶点和手段。第一部分Twist-2在内毒素耐受小鼠肝组织中表达变化及意义的研究目的建立内毒素耐受小鼠模型,观察内毒素耐受小鼠接受大剂量LPS刺激前后Twist-2在肝组织中的表达变化情况,从机体水平初步探讨Twist-2与内毒素耐受之间的关系。方法通过对实验动物处理方式的不同,随机分为内毒素非耐受组（NETT）和耐受组（ETT）。比较两组实验动物的一般情况;光镜观察肝组织病理学改变;电镜观察肝脏细胞超微结构改变;转录因子分析试剂盒检测NF-κB活性;酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血浆中的TNF-α水平;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝组织TNF-α及Twist-2的mRNA表达水平。结果（1）成功建立了内毒素耐受小鼠模型;（2） EET组小鼠各时相点血浆TNF-α含量、肝组织中TNF-α表达明显减弱、肝组织中NF-κB活性显著降低（P<0.05）;（3） NETT组在LPS刺激24h后才能在肝组织中检测到Twist-2的mRNA表达,而ETT组肝组织中Twist-2 mRNA表达在0h时已能检测,并在LPS刺激后迅速上调,于6h时达高峰,24h时其表达强度仍为非耐受组2.5倍。结论LPS预处理能成功诱导小鼠内毒素耐受;肝组织中Twist-2高表达表达及Kupffer细胞活化受到抑制可能与内毒素耐受的形成有关。第二部分Twist-2在内毒素耐受Kupffer细胞中的表达及意义目的观察内毒素耐受时Twist-2在kupffer细胞中表达变化情况,并探讨其在Kupffer细胞内毒素耐受中的作用及意义。方法通过分离培养kupffer细胞,根据处理方式的不同分为非耐受组（NETT）和耐受组（ETT）。分别用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测kupffer细胞中Twist-2;TNF-αmRNA表达水平;蛋白印迹法（Western Blotting）检测Twist-2蛋白表达情况;以及Trans AM NF-κB Kit检测kupffer细胞内核转录因子（NF-κB）的相对活性;用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养液中TNF-α的水平。结果（1）成功诱导内毒素耐受Kupffer细胞模型;（2）内毒素非耐受组的NF-κB相对活性、TNF-α含量和表达均较耐受组明显升高（P<0.05）,（3） RT-PCR和Western blotting分析显示:NETT组细胞在LPS刺激24h后才能检测出Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白的表达,而ETT组细胞在LPS刺激前已可检测到Twist-2的基因表达,且该表达随LPS刺激的持续而维持在较高水平。结论内毒素耐受状态下,Twist-2基因转录和翻译水平明显上调,而kupffer细胞的活性受到明显抑制,但未完全丧失,提示Twist-2具有负性调控KCs的活性的作用,在内毒素耐受的形成中起重要作用,但并非内毒素耐受的唯一机制,可能还有其它机制在内毒素耐受的形成中发挥作用。第三部分Twist-2特异性RNA干扰对Kupffer细胞内毒素耐受性的影响目的应用RNA干扰技术（RNAi）沉寂Kupffer细胞Twist-2基因表达,观察细胞内毒素耐受性的改变,探讨Twist-2在内毒素耐受形成中的作用。方法应用Twist-2特异性shRNA质粒,转染Kupffer细胞,以载体pGenesil-1转染为阴性对照,分为pTwist-2-shRNA转染组和pGenesil-1组,两组先经10ng/ml LPS预处理后,再用100ng/ml LPS进行孵育;用ELISA检测培养液中的TNF-α水平;RT-PCR检测细胞中的Twist-2 mRNA表达;用TransAM NF-κB Kit检测细胞中NF-κB活性,Western blotting检测其对Twist-2蛋白表达。结果（1） pGenesil-1载体转染对Twist-2 mRNA表达无明显抑制作用,可作为阴性对照。（2） pGenesil-1组中Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白水平明显高于pTwist-2-shRNA转染组,而pGenesil-1组细胞培养液中TNF-α水平、NF-κB活性明显低于pTwist-2-shRNA转染组,各项指标比较均有显著性差异。结论RNA干扰抑制Twist-2基因表达后,Kupffer细胞的内毒素耐受性明显减弱,表明Twist-2表达在内毒素耐受的形成机制中发挥着重要的作用。
论文目录
相关论文文献
- [1].Kupffer细胞在肝移植缺血再灌注损伤中的作用[J]. 中国普外基础与临床杂志 2020(10)
- [2].大鼠肝纤维化进程中原代Kupffer细胞吞噬能力及表型变化特征研究[J]. 免疫学杂志 2019(03)
- [3].Kupffer细胞在非酒精性脂肪肝病中的作用[J]. 生命的化学 2019(03)
- [4].Inflammation-induced CD69~+ Kupffer cell feedback inhibits T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1[J]. Science China(Life Sciences) 2016(12)
- [5].大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现[J]. 大众科技 2017(12)
- [6].Kupffer细胞在乙型和丙型病毒性肝炎发病机制中的作用[J]. 中国现代普通外科进展 2016(05)
- [7].Kupffer细胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2015(03)
- [8].Alcoholic hepatitis: The pivotal role of Kupffer cells[J]. World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology 2015(04)
- [9].Kupffer细胞与肝缺血再灌注损伤[J]. 胃肠病学和肝病学杂志 2013(09)
- [10].Ron receptor-dependent gene regulation of Kupffer cells during endotoxemia[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International 2014(03)
- [11].Hyaluronic acid fragments evoke Kupffer cells via TLR4 signaling pathway[J]. Science in China(Series C:Life Sciences) 2009(02)
- [12].Laser capture microdissection and genetic analysis of carbon-labeled Kupffer cells[J]. World Journal of Gastroenterology 2009(14)
- [13].Prokineticin 2/Bv8 is expressed in Kupffer cells in liver and is down regulated in human hepatocellular carcinoma[J]. World Journal of Gastroenterology 2008(08)
- [14].脂多糖诱导Kupffer细胞激活、焦亡及耐受机制研究进展[J]. 重庆医学 2019(15)
- [15].脂多糖对肝脏Kupffer细胞增殖和分泌功能及超微结构的影响[J]. 解放军医药杂志 2017(10)
- [16].大鼠肝Kupffer细胞分离方法改进[J]. 生物医学工程与临床 2015(05)
- [17].T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3对干扰素-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性细胞因子的调节作用及机制[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版) 2015(05)
- [18].白术多糖对小鼠Kupffer细胞免疫功能的激活作用[J]. 西北药学杂志 2013(06)
- [19].改进的大鼠原代Kupffer细胞分离与鉴定方法[J]. 临床与实验病理学杂志 2012(04)
- [20].Effects of Different Therapeutic Methods and Typical Recipes of Chinese Medicine on Activation of c-Jun N-terminal Kinase in Kupffer Cells of Rats with Fatty Liver Disease[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine 2012(10)
- [21].Kupffer cells contribute to concanavalin A-induced hepatic injury through a Th1 but not Th17 type response-dependent pathway in mice[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International 2011(02)
- [22].Heme oxygenase-1 protects donor livers from ischemia/reperfusion injury:The role of Kupffer cells[J]. World Journal of Gastroenterology 2010(10)
- [23].大鼠Kupffer细胞分离方法的优化[J]. 山西中医学院学报 2018(04)
- [24].牛磺熊去氧胆酸抑制Kupffer细胞减轻大鼠肝移植后缺血再灌注损伤[J]. 第三军医大学学报 2018(18)
- [25].M2-like Kupffer cells in fibrotic liver may protect against acute insult[J]. World Journal of Gastroenterology 2017(20)
- [26].Kupffer细胞在梗阻性黄疸致肝损害作用中的研究进展[J]. 腹部外科 2016(05)
- [27].Kupffer细胞与肝纤维化关系的研究进展[J]. 宜春学院学报 2015(03)
- [28].Kupffer细胞在非酒精性脂肪性肝病形成中的作用[J]. 中国中医药现代远程教育 2010(09)
- [29].乙醛及其刺激的Kupffer细胞对肝星状细胞活化的影响[J]. 现代医学 2009(01)
- [30].Role of liver X receptors alpha agonist on expressions of LPS-induced inflammatory response associated factor IRAK-4 and NF-kappaB in Kupffer cells[J]. Journal of Medical Colleges of PLA 2008(02)