辣椒均一化全长cDNA文库的构建及若干重要基因的表达或功能分析

论文摘要

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种具有重要经济价值的茄科作物，而在生产过程中包括病害在内的各种生物和非生物逆境的发生严重地影响辣椒的产量和质量。培育，推广及应用抗逆品种是当前和今后解决辣椒品质问题的最为根本有效的技术对策，辣椒抗病分子机制的阐明则有利于促进现代生物技术和常规育种相结合，进而有效的促进辣椒抗逆遗传改良。大量的研究表明，包括病原菌在内的逆境胁迫可激活植物防御反应，这种诱导抗性在植物抗逆过程中起重要作用，这一过程受逆境胁迫下信号传递途径的控制，其中转录因子通过整合外界信号和协调基因表达的过程中起重要作用参与了该过程。开展辣椒应答逆境的重要转录因子的结构和功能鉴定有利于揭示辣椒抗逆分子机制，促进辣椒抗逆遗传改良。因此，本研究为了分离获得若干可能在辣椒抗病或抗逆防御反应中起重要调节作用转录因子，首先构建了外源SA处理的辣椒均一化cDNA文库，从中分别分离获得2个NAC和1个ERF转录因子阳性克隆，对所分离阳性克隆进行了与特定顺式作用原件互作的瞬间表达、亚细胞定位以及在不同逆境下转录表达的荧光定量PCR分析，并对ERF在烟草中超表达对青枯菌接种抗性和高温抗性的影响进行了分析，主要研究结果如下：1.采用DSN均一化技术与SMART建库技术相结合的方法，构建了在SA处理下辣椒全长均一化cDNA文库，该文库含有1.8×106个独立克隆，插入片段平均长度为1. 5 kb，重组率为99%，经测序获得unigenes数目为817，冗余度为5.5%，文库的均一化效果良好，质量符合要求。2.采用文库稀释池法从全长均一化cDNA文库中分离获得了两个辣椒NAC阳性克隆CaNAC6和CaNAC2。两个NAC蛋白都包含有NAC类转录因子特有的NAC域和C末端的可变域。蛋白结构域和分子进化分析表明CaNAC6属于第Ⅲ（stress-related NAC genes, SNAC）亚族，CaNAC2属于第Ⅰ-5（NAC2）亚族。酵母实验表明，CaNAC6和CaNAC2的C末端均具有转录激活活性。两个蛋白均可结合NAC类转录因子的识别序列NACRS序列。基因枪介导的洋葱表皮转化实验表明，35S::CaNAC6-GFP融合蛋白定位于细胞核中，35S::CaNAC2-GFP融合蛋白在细胞核和细胞膜中均有表达。荧光定量结果表明，NAA处理下CaNAC6上调表达，CaNAC2在短时间内表现为下调。CaNAC6可由SA，MeJA，ETH，ABA，机械损伤，青枯菌及干旱诱导表达。CaNAC2由SA，MeJA，青枯菌，干旱诱导表达，ABA作用下无明显变化，在乙烯利作用下表现为一定程度的下调。两个基因的表达水平在4℃冷处理时均在处理后48 h上调，在NaCl和42℃高温处理一定时间内都表现出下调。4.从均一化cDNA文库中分离了一个辣椒ERF阳性克隆CaERF5。洋葱表皮转化实验表明35S::CaERF5-GFP融合蛋白定位于细胞核中。瞬时表达结果表明CaERF5结合GCC-box而不结合CRT/DRE元件。分子进化和序列分析表明CaERF5属于ERF转录因子bⅨ亚族家族成员。5.表达模式分析表明，CaERF5在青枯菌侵染后24-96 h间上调表达，并受SA，MeJA，ETH，机械损伤、低温、高温作用诱导，但不受ABA诱导，在干旱处理下下调表达。相对于K326，除NtNPR1外，包括NtPR2，Ntosmotin，NtACS，NtPR1b，NtPR3，NtPRQ，NtMLP2及NtGST1在内的防御反应相关基因在过量表达CaERF5转基因株系中表达量显著上调。CaERF5过量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因Ntosmotin，NtNPR1，NtPR3，NtPR1b，NtPRQ，NtMLP2，NtCAT1，NtGST1及NtACC均在48 h和96 h表达量无明显组间差异，而在野生型K326中，接种青枯菌96 h后这一系列基因依然呈诱导表达状态。此外，青枯菌接种48h和96h后过量表达CaERF5植株中两个热激蛋白基因（NtHSP和NtHSP18）表达水平较K326均有一定程度的提高。42℃高温处理下CaERF5转基因株系在高温胁迫下萌芽率明显高于K326，并且幼苗表现出较强的高温耐受能力。综上所述，本研究构建了一个外源SA处理的辣椒均一化cDNA文库，从中分离获得2个NAC（CaNAC6和CaNAC2）和1个ERF（CaERF5）转录因子阳性克隆，初步分析表明，CaNAC6和CaNAC2可能参与了辣椒响应不同生物和非生物逆境的过程。定位于细胞核可与GCC盒结合的CaERF5的转录表达同样受各种生物和非生物逆境不同程度诱导，过量表达CaERF5显著提高转基因烟草一系列防御反应相关基因的表达，并介导了转基因烟草对高温和青枯病的抗性。

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摘要

Abstract

缩略词表

第一章辣椒均一化全长cDNA 文库的构建

1.1 引言

1.2 材料与方法

1.2.1 主要供试材料

1.2.2 全长cDNA 的合成

1.2.3 全长cDNA 的均一化

1.2.4 均一化全长cDNA 文库的构建

1.2.5 序列测定与分析

1.3 结果与分析

1.3.1 全长cDNA 的合成

1.3.2 文库均一化效果检测

1.3.3 文库插入片段大小及库容检测

1.3.4 cDNA 测序结果分析

1.4 讨论

小结

第二章辣椒CaNAC6 和CaNAC2 结构和表达分析

2.1 引言

2.1.1 本研究的目的和意义

2.1.2 NAC 类转录因子结构、作用机制及功能

2.1.2.1 NAC 类转录因子的结构与分类

2.1.2.2 NAC 类转录因子的作用机制

2.1.2.3 NAC 类转录因子在植物生长发育及逆境防御反应过程中的功能

2.1.3 本研究的主要内容

2.2 材料与方法

2.2.1 主要供试材料及生长条件

2.2.2 NAC 基因的分离和序列分析

2.2.3 载体构建

2.2.4 亚细胞定位分析

2.2.5 瞬间表达分析

2.2.6 转录激活活性分析

2.2.7 基因表达模式分析

2.3 结果与分析

2.3.1 辣椒CaNAC6 和CaNAC2 基因全长cDNA 的分离

2.3.2 辣椒CaNAC6 和CaNAC2 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析

2.3.3 CaNAC6 和CaNAC2 与NAC 识别元件NACRS 的瞬间表达分析

2.3.4 CaNAC6 和CaNAC2 的亚细胞定位分析

2.3.5 CaNAC6 和CaNAC2 在酵母细胞中的转录激活活性分析

2.3.6 CaNAC6 和CaNAC2 基因的表达模式分析

2.3.6.1 CaNAC6 和CaNAC2 基因在辣椒不同组织和发育阶段的表达分析

2.3.6.2 CaNAC6 和CaNAC2 基因在逆境胁迫应答下的表达模式分析

2.4 讨论

2.4.1 CaNAC6 和CaNAC2 是辣椒NAC 转录因子家族成员

2.4.2 辣椒CaNAC6 和CaNAC2 可能参与了辣椒响应不同生物和非生物逆境的过程

小结

第三章辣椒CaERF5 转录因子结构与功能分析

3.1 引言

3.1.1 ERF 类转录因子的研究进展

3.1.1.1 ERF 类转录因子结构、分类及作用机制

3.1.1.2 ERF 类转录因子在植物胁迫应答中的功能

3.1.2 本研究的目的及意义

3.2 材料与方法

3.2.1 主要供试材料及生长条件

3.2.2 CaERF5 基因的分离和序列分析

3.2.3 载体构建

3.2.4 亚细胞定位分析

3.2.5 瞬间表达分析

3.2.6 基因表达模式分析

3.2.7 烟草遗传转化

3.2.8 转基因烟草表型分析与功能鉴定

3.2.8.1 转基因烟草高温胁迫分析

3.2.8.2 转基因烟草抗病分析

3.3 结果与分析

3.3.1 辣椒CaERF5 基因全长cDNA 的分离

3.3.2 辣椒CaERF5 基因推导的蛋白结构域及系统进化分析

3.3.3 CaERF5 与GCC-box 及CRT/DRE 顺式作用元件的瞬间表达分析

3.3.4 CaERF5 的亚细胞定位分析

3.3.5 CaERF5 基因的表达模式分析

3.3.5.1 CaERF5 基因在辣椒不同组织和发育阶段的表达分析

3.3.5.2 CaERF5 基因在逆境胁迫应答下的表达模式分析

3.3.6 CaERF5 基因超表达烟草植株的功能鉴定及表型分析

3.3.6.1 CaERF5 转基因植株在高温胁迫下的表型分析

3.3.6.2 CaERF5 转基因植株在青枯菌处理下的表型分析

3.3.6.3 CaERF5 过量表达对防御反应相关基因表达量的影响

3.3.6.4 青枯菌侵染对CaERF5 转基因植株下游防御反应基因表达水平的影响

3.4 讨论

3.4.1 CaERF5 是定位于细胞核、可与GCC 盒结合的辣椒ERF 转录因子家族成员

3.4.2 CaERF5 是辣椒中SA 和JA/ET 信号途径中的重要节点，参与对青枯病的抗性

3.4.3 CaERF5 同时参与了植物对高温和青枯病抗性的调节

小结

参考文献

附录

附录1 部分EST 与GenBank 中同源性最高基因比对信息

附录2 辣椒CaNAC6 和CaNAC2 基因cDNA 及推定的氨基酸序列

附录3 主要质粒图谱

博士就读期间发表论文情况

致谢

辣椒均一化全长cDNA文库的构建及若干重要基因的表达或功能分析

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