山莨菪碱抗感染性休克作用与白介素10

论文摘要

感染性休克是一个以急性微循环障碍为主的综合征,发病急,病死率高。主要症状是体内重要脏器的低灌流状态,使机体细胞无法维持正常的营养代谢和功能,临床表现为低血压、血管损伤、弥漫性血管内凝血,最终导致多脏器功能衰竭（Multipe organ dysfunction syndrome,MODS）使休克难以逆转。目前认为内毒素（endotoxic）是革兰氏阴性细菌败血症所致休克和多器官功能衰竭综合征的主要因素。内毒素休克主要由革兰氏阴性菌感染所致,是由于大量内毒素诱导产生多种炎性介质级联反应,使机体处于一种自身无法控制的紊乱状态。感染性休克的发病机制极为复杂,了解感染性休克过程脂多糖（LPS）的致病机制和休克的病理生理变化,是临床合理治疗感染性休克的基础。山莨菪碱是我国从特产茄科植物唐古特山莨菪（Anisodus Tonguticus）中提取的一种生物碱,人工合成后也称“654-2”。自6O年代以来应用于抗休克治疗,但对于其确切的作用机制尚未完全阐明。有人将其作用归结为抑制去甲肾上腺素诱导的微血管痉挛、扩张小血管和对抗自由基损伤。近年来有报导称山莨菪碱的抗休克作用可能与减少血小板内血栓素合成、抑制粒细胞和血小板的聚集密切相关,同时也可以拮抗内毒素对白细胞流态和功能的干扰,减少白细胞附壁滚动和粘附,降低内皮细胞与白细胞的粘附系数,加快血液流速等。山莨菪碱还能降低离体组织中的丙二醛含量,保护内毒素激活的多形核细胞对血管内皮细胞的损伤,稳定内皮细胞膜。近年来发现在感染性休克或多器官功能衰竭的发生过程中,有激活的巨噬细胞释放的炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）,白介素1（IL- 1）和白介素（IL- 6）,在促进机体的急性期炎症反应中起了关键作用。然而白介素10（IL- 10）对免疫应答有抑制作用,可减少这些炎性细胞因子的释放,在动物实验中它能阻止葡萄球菌肠毒素诱导的休克,能明显减轻脂多糖诱导的内毒素血症的症状。目前所发现的IL-10家族成员均为分泌性蛋白,大都由活化的T细胞或单核细胞表达、分泌后与靶细胞上的两个受体亚单位结合,从而激活信号转导和转录激活蛋白（ signal trans2ducer and activator of transcription ,STAT）转位而发挥效应功能。动物实验表明,IL-10缺乏,鼠血浆炎症因子水平明显增高,死亡率也增高。反之,注射重组IL-10后对内毒素的攻击有明显保护作用,炎症因子及死亡率均下降。IL-10对免疫应答主要起抑制作用,动物实验显示它可以改善脓毒血症预后,降低死亡率。IL-10这种作用可能是通过抑制内毒素诱导激活的单核细胞、巨噬细胞、Th细胞释放炎性细胞因子来实现的。我们假设山莨菪碱能够激活IL-10,从而起到抗休克作用。因此,本实验旨在论证:在山莨菪碱抗休克的过程中,IL-10是否参与其中。本实验的结果将为山莨菪碱抗休克作用提供新的理论机制。方法1.实验一:山莨菪碱抗内毒素休克作用的研究:采用昆明种雄性小鼠。18-22g雄性小鼠120只腹腔注射内毒素（lipopolysaccharide, LPS）50mg/kg,注射后将小鼠随机分为6组:①对照组;②山莨菪碱40mg/kg治疗组;③山莨菪碱80mg/kg治疗组;④山莨菪碱120mg/kg治疗组;⑤山莨菪碱160mg/kg治疗组;⑥山莨菪碱200mg/kg治疗组,观察24小时的死亡情况。2.实验二:山莨菪碱对IL-10基因敲除（knock-out）小鼠抗内毒素休克作用的研究:采用IL-10 knock-out小鼠。25-30g雄性小鼠40只腹腔注射内毒素（lipopolysaccharide, LPS）200mg/kg,注射后将小鼠随机分为两组:①对照组;②山莨菪碱治疗组（150mg/kg）,观察24小时的死亡情况。3.实验三:山莨菪碱对内毒素诱导的巨噬细胞IL-10表达影响的研究:将纯化的巨噬细胞分为7组,在6孔板中加入含10%胎牛血清、50uM巯基乙醇、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、10mM丙酮酸钠和50ug/m庆大霉素的培养液孵育（每孔5×104个细胞）,18小时后给药处理:①对照组;②内毒素（1mg/L）处理组;③山莨菪碱100mg/L处理组;④内毒素1mg/L+山莨菪碱10mg/L处理组;⑤内毒素1mg/L+山莨菪碱50mg/L处理组;⑥内毒素1mg/L+山莨菪碱100mg/L处理组;⑦内毒素1mg/L+山莨菪碱500mg/L处理组。在37℃,5%CO2孵箱内孵育4h,取上清液用ELASA法测定IL-10的含量。4.数据处理采用SAS软件进行分析,实验一和实验二中,生存率差异的分析采用Kaplan-Meier分析方法,Log-Rank检验不同生存曲线的差异。实验三采用单因素方差分析比较组间差异（ANVOA）。所用数据均以均数±标准差（mean±SD）表示,P<0.05为差别有显著意义, P<0.01为差别有高度显著意义。结果实验一:对照组和山莨菪碱5个不同剂量处理组之间,其24小时生存率存在显著性差异（Log-Rank检验χ2=21.7, P<0.001）。对照组死亡率达到80%,山莨菪碱40,80, 120, 160, 200 mg/kg治疗组的死亡率分别为45%, 40%, 10%, 40%和55%。从40mg/kg到120mg/kg范围,山莨菪碱抗内毒素休克死亡的作用呈剂量依赖性的提高（生存率从55%增加到90%）;从120mg/kg到200mg/kg范围,山莨菪碱抗内毒素休克死亡的作用呈剂量依赖性的降低（生存率从90%降低到45%）。实验二:对照组和山莨菪碱150mg/kg处理组之间,其24小时生存率存在显著性差异（Log-Rank检验χ2=4.59, P<0.05）。对照组死亡率达到50%,山莨菪碱治疗组的死亡率仅为20%。实验三:内毒素（1 mg/L）和山莨菪碱（100 mg/L）单独刺激巨噬细胞都不能显著影响巨噬细胞分泌IL-10,用内毒素（1 mg/L）和不同浓度的山莨菪碱共孵育巨噬细胞,可剂量依赖性的降低IL-10的分泌。其中,与内毒素（1 mg/L）单独刺激组比较,共孵育组山莨菪碱100和500 mg/L组具有显著性（P<0.05）。结论在一定的剂量范围内,山莨菪碱显著的呈剂量依赖性的增加内毒素休克小鼠的生存率,这种作用可能不依赖于IL-10的表达。

论文目录

• 缩写词汇表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 附发表的文章
• 致谢