草莓转基因再生体系的建立及早花基因PcFT的转化

论文摘要

草莓（Fragaria×ananassa Duch）是世界上最重要的草本果树之一，生长周期短，果实风味浓郁、香味独特，是最好的城市圈经济栽培的浆果。草莓花芽分化需低温和短日照，在露地栽培条件下4月底5月初成熟，供应期较短；促成和半促成栽培条件下，虽然果实成熟期可扩大至11月底～次年5月，但其余季节里仍无果实供应。如何调控其花芽分化，在适宜的时间结果，扩大其市场供应期，提高经济效益，是科研和生产中需要解决的一个重要课题。植物基因工程的发展和应用为草莓育种开辟了一条新途径。由于农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料的再生能力及农杆菌的转化效率，因此，良好而高效的受体再生体系的建立是进行成功的基因转化关键所在。本试验以草莓品种‘红颊’和‘丰香’为试材，以草莓叶片和花药为外植体，研究了离体再生过程中基因型、外植体、激素配比、暗培养时间等对不定芽再生效率的影响，建立了草莓叶片高效离体再生体系。在此基础上，对影响农杆菌转化效率的主要因素进行筛选，建立了农杆菌介导的转化体系，将早实枳中分离获得的早花基因PcFT导入草莓，获得转化植株。Km筛选、PCR检测证明目的基因已经整合到草莓基因组中。主要研究结果如下：1．研究了草莓‘红颊’花药再生的影响因素以花粉发育时期为单核靠边期的草莓红颊花药，在培养基MS+1．0mg／L TDZ+0．4 mg／L IBA上诱导效果最佳，绿苗分化率达到12．3％，单倍体诱导率为1．11％。2．建立了草莓叶片离体再生体系在不定芽诱导中以MS+1．5 mg/L TDZ+0．4 mg／L IBA对草莓‘红颊’叶片诱导效果最佳，适量暗培养有助于提高再生频率，暗培养4周再生频率可达为67．8％；以MS+1．0 mg/L TDZ+0．6 mg/L IBA，暗培养3周对丰香诱导效果最好，再生频率可达78．7％。草莓‘红颊’再生难度及价值比‘丰香’高，选择草莓红颊进行进一步遗传转化的研究。3．构建了表达载体pBI121-FT。4．建立了草莓遗传转化体系，并获得一棵草莓品种‘红颊’转化植株。在根癌农杆菌介导的基因转化中，确定了有效的Km选择压为10 mg/L。通过抑菌实验，确定了合适的抗菌素及其浓度，即400mg／L Cef。对影响农杆菌转化效率的各种因素进行筛选，得到了一条最佳的转化途径：叶片在分化培养基上预培养时间为3天；农杆菌培养至对数生长期，用MS+TDZ1．5mg/L+IBA 0．4mg／L液体培养基重新稀释悬浮培养；调整菌液浓度为OD600=0．3-0．5；侵染叶盘组织约10分钟；共培养3天；然后，延迟2周筛选，即将外植体接到含有400 mg/L Cef的诱导培养基上进行培养，2周后再转接到含有选择压10 mg／LKm和400 mg／LCef的诱导培养基上进行选择培养。5．转基因植株PCR检测经10 mg／L Km选择压初步筛选出10棵‘红颊’转化植株，以未转化植株为阴性对照，质粒DNA为阳性对照，PcFT基因的两端序列作为特异引物进行PCR扩增检测。检测结果表明：在这些植株中有1棵植株经PCR扩增出的特异条带和阳性对照一致，阴性对照未能扩增出任何条带。这表明PcFT基因已整合进这些植株的基因组DNA中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATION）
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 草莓离体再生研究进展
• 1.2.1 基本培养基
• 1.2.2 外植体
• 1.2.2.1 基因型
• 1.2.2.2 外植体类型
• 1.2.2.3 生理状态
• 1.2.2.4 接种方式及切割处理
• 1.2.3 激素与添加物
• 1.2.3.1 激素
• 1.2.3.2 附加物
• 1.2.4 培养条件
• 1.3 草莓遗传转化研究进展
• 1.3.1 外植体对转化效率的影响
• 1.3.1.1 基因型对转化效率的影响
• 1.3.1.2 叶龄对转化效率的影响
• 1.3.1.3 预培养时间对转化效率的影响
• 1.3.2 农杆菌侵染对转化效率的影响
• 1.3.2.1 工程菌液的浓度
• 1.3.2.2 工程菌液侵染的时间
• 1.3.2.3 AS对转化效率的影响
• 1.3.2.4 共培养对转化效率的影响
• 1.3.2.5 延迟培养与选择性培养
• 1.4 FLOWER LOCUS T（FT）基因研究进展
• 1.5 研究的目的和内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 2 草莓花药再生体系的摸索
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 小孢子发育时期的确定
• 2.2.1.1 临时切片的制作
• 2.2.1.2 花药石蜡切片的制作
• 2.2.2 花药的接种与培养
• 2.2.2.1 培养基配方
• 2.2.2.2 花药接种步骤
• 2.2.2.3 花药培养条件
• 2.2.2.4 数据调查与统计
• 2.2.2.5 再生植株倍性鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 愈伤组织分化和绿苗的产生
• 2.3.2 培养基中不同激素浓度对愈伤组织诱导率和绿苗分化率的影响
• 2.3.3 草莓花粉不同发育时期对诱导愈伤组织的影响
• 2.3.4 花药再生植株的倍性的鉴定
• 2.3.5 单倍体成苗率的统计
• 3 草莓叶片再生体系的建立
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 草莓无菌试管苗材料的准备
• 3.2.2 接种方法
• 3.2.3 试验处理
• 3.2.3.1 不同基本培养基对叶片再生不定芽的影响
• 3.2.3.2 不同暗培养时间对叶片再生不定芽的影响
• 3.2.3.3 数据统计
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同激素组合对草莓不定芽分化的影响
• 3.3.2 暗处理对草莓不定芽分化的影响
• 4 PCFT基因表达载体的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 酶及生化试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.2 方法
• 4.2.1 pBI121-PcFT植物表达载体构建流程图
• 4.2.2 pBI121-PcFT植物表达载体示意图
• 4.2.3 小量提取质粒DNA
• 4.2.4 目的条带的回收纯化
• 4.2.5 TA克隆
• 4.2.5.1 反应体系
• 4.2.5.2 TA克隆引物
• 4.2.5.3 酶切
• 4.2.5.4 连接
• 2法制备感受态'>4.2.5.5 CaCl₂法制备感受态
• 4.2.5.6 转化
• 4.2.6 重组质粒的鉴定
• 4.2.7 目的基因的序列测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 pBI121-PcFT植物表达载体的酶切鉴定
• 4.3.2 目的基因的序列测定
• 5 根癌农杆菌介导法转化草莓
• 5.1 材料
• 5.1.1 培养基
• 5.1.2 抗生素
• 5.2 方法
• 5.2.1 选择培养中Km选择压的确定
• 5.2.2 选择培养中抑菌抗生素及浓度的确定
• 5.2.3 农杆菌叶盘法的转化程序
• 5.2.3.1 菌液的制备:
• 5.2.3.2 受体材料的预培养
• 5.2.3.3 农杆菌侵染
• 5.2.3.4 受体材料的共培养、选择培养、继代培养
• 5.2.4 转化因子的筛选
• 5.2.4.1 菌液浓度
• 5.2.4.2 侵染时间
• 5.2.4.3 预培养时间
• 5.2.4.4 共培养时间
• 5.2.4.5 选择方式
• 5.2.5 抗性芽的增殖、生根
• 5.2.6 GUS染色瞬间表达鉴定
• 5.2.6.1 GUS染色瞬间表达鉴定步骤
• 5.2.6.2 GUS检测液配制
• 5.2.7 评价指标
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 培养基中Km选择压的确定
• 5.3.2 Cef抑菌浓度的确定
• 5.3.3 转化因子的筛选
• 5.3.3.1 菌液浓度对GUS瞬时表达率的影响
• 5.3.3.2 菌液侵染时间对GUS瞬时表达率的影响
• 5.3.3.3 预培养时间对转化率的影响
• 5.3.3.4 共培养时间对转化率的影响
• 5.3.3.5 筛选方式对转化率的影响
• 6 转基因草莓的分子生物学鉴定
• 6.1 方法
• 6.1.1 PCR引物
• 6.1.2 PCR扩增体系
• 6.2 结果
• 6.2.1 转化植株的获得
• 6.2.2 转化阳性苗PCR鉴定
• 7 讨论
• 7.1 草莓花药再生体系的摸索
• 7.2 生长调节物质和暗处理对叶片再生频率的影响
• 7.2.1 生长调节物质
• 7.2.2 暗处理
• 7.3 根癌农杆菌介导的草莓转化
• 7.3.1 要选择合适的Km选择压和Cef抑菌浓度
• 7.3.2 关于转化体的筛选方法
• 7.3.3 GUS报告基因的瞬间表达对判断菌液侵染时间和最合适侵染浓度的借鉴作用
• 参考文献
• 致谢