低温条件下小麦返白系中叶绿体果糖1，6-二磷酸醛缩酶的初步研究

论文摘要

小麦返白系是在研究冬小麦矮变1号时发现的叶片白化自然突变体,对低温敏感,在冬春季节表现叶片白化现象,是一个能够稳定遗传的特殊遗传材料。目前,已从遗传学、生理生化、叶绿体发育、细胞学等方面对小麦返白系进行了较全面深入的研究,取得了大量重要结果。本研究依据前期侯典云博士等对低温条件下的返白系与亲本矮变1号叶片叶绿体蛋白质组研究结果,选取表达量有差异的叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（CpFBA）作为研究对象,该酶在低温胁迫下返白系中的表达量明显低于对照材料。果糖-1,6-二磷酸醛缩酶是Calvin循环的重要限速酶之一,参与叶绿体的碳,氮代谢。盐胁迫下,转基因烟草、盐藻和鱼腥藻的光合速率及活性明显提高。本文通过叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因序列比对,酶活性测定,实时定量检测、瞬时表达载体转化原生质体等,初步研究小麦叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶编码基因的分子特征和低温条件下的表达模式,并着重研究对低温敏感的返白系中酶的表达特异性。试验主要得到以下结果:1、我们克隆到了返白系与矮变1号的叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因组DNA和cDNA,从基因序列比对来看,这两个材料的CpFBA的基因序列基本一致,与已公布的CpFBA基因（Genebank accession No. FJ625793）相比,编码多肽有三个位点的氨基酸残基存在差异。2、室温下,返白系与矮变1号叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性差异不大。低温处理后,酶活性发生明显变化,而且两个材料活性变化趋势存在差异:矮变1号的酶活性呈“升高-降低-升高”的周期性变化,而返白系在低温处理第4天时CpFBA酶活性升至最高,之后酶活性逐渐降低。3、我们初步建立了植物原生质体转化体系,并将小麦返白系叶绿体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶+eGFP融合基因的瞬时表达载体转入韭菜原生质体,观察到了eGFP在细胞质中的表达。4、荧光实时定量PCR检测CpFBA基因在常温和低温条件下的变化趋势,结果显示:在常温下,两个材料基因的表达量相差不大,矮变1号醛缩酶表达量较高。低温处理后的第4天,返白系中的基因表达量显著降低,矮变1号的表达量升高,高于小麦返白系。在随后持续处理的时间中,矮变1号基因的表达量持续低于常温条件,基本稳定;而返白系中在低温处理第4天之后基因表达量开始逐渐增加,在低温处理第34天,也即处理一个月后表达量出现最高值,与低温处理后第4天矮变1号的表达量相当。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1.1 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶
• 1.1.1 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶生物学特性
• 1.1.2 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶在碳固定反应中的地位
• 1.1.3 植物中FBA 的研究进展
• 1.1.4 FBA 在小麦返白系中的研究状况
• 1.2 实时定量PCR 技术及其应用
• 1.2.1 实时定量PCR 技术的原理
• 1.2.2 实时定量PCR（RQ-PCR）技术的应用
• 1.3 植物原生质体瞬时表达技术研究进展
• 1.3.1 瞬时表达技术及其研究意义
• 1.3.2 原生质体的转化方法
• 1.4 小麦wcs120 基因及启动子研究现况
• 1.4.1 wcs120 基因
• 1.4.2 wcs120 启动子的结构特征
• 1.4.3 wcs120 启动子的研究状况
• 1.5 本研究的目的与意义
• 1.6 本文的研究技术路线
• 第二章 小麦返白系叶绿体FBA 基因的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 cDNA 克隆与序列分析
• 2.2.2 基因组的克隆与序列比较
• 第三章 低温条件下小麦返白系和矮变1 号FBA 活性变化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要仪器和试剂
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 连续循环反应光谱法检测FBA 酶活性的结果
• 3.2.2 用谢里万诺夫法测定CpFBA
• 3.2.3 低温条件下小麦中CpFBA 的酶活性变化
• 第四章 FBA 瞬时表达载体的构建与转化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 仪器与试剂
• 4.1.3 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 连接结果验证
• 4.2.2 小麦和韭菜原生质体的制备效果
• 4.2.3 韭菜原生质体的转化结果
• 第五章 低温下小麦返白系和矮变1 号CpFBA 的基因表达差异
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 耗材与仪器
• 5.1.3 方法
• 5.2 实时定量结果与分析
• 第六章 低温诱导启动子WCS120 的克隆
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 方法
• 6.2 结果与分析
• 第七章 讨论与结论
• 7.1 讨论
• 7.1.1 关于FBA 酶活性的测定
• 7.1.2 关于FBA 在逆境条件下的表现与功能
• 7.1.3 返白系中的CpFBA
• 7.2 结论
• 7.3 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介