SrTRAIL的表达与DR5单抗的人源化改造

论文摘要

TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）是属于TNF超家族的二型跨膜蛋白,在正常人体的器官和组织中广泛表达。它能够引起包括肿瘤细胞及一些转化细胞的凋亡。TRAIL和TNFα及FasL有非常高的同源性。但是TNFα及FasL分别因为能够引起致命性的炎症反应,导致脓毒性休克症和引起致死性肝衰竭而限制了其在临床上的应用。TRAIL由于能够选择性的诱导肿瘤细胞凋亡而在肿瘤生物治疗上有广泛的应用前景。TRAIL也能和传统的放化疗起到协同增强的效应。但是有报道称不同形式的重组TRAIL会在抗肿瘤效应和细胞毒性上有所不同。所以人们一方面在继续关注TRAIL的安全性,另一方面也在积极的寻找TRAIL的替代品。而抗DR4、DR5单抗由于也能够通过和死亡受体结合而向下传递凋亡信号,最终引起靶细胞的凋亡而成为理想的候选者。自2001年TRA-8（抗DR5单抗）面世以来,就由于其良好的抗肿瘤活性而且对正常组织细胞没有毒性给人们很大的信心。近年来对于抗DR4,DR5的抗体,国内外进行了很多的研究,但是至今还没有上市的药物。本研究就是一方面通过分子生物学的方法实现两种不同形式的人源TRAIL胞外段结构域（ 114- 281aa）在大肠杆菌中的可溶性表达,一种是在其氨基末端加上多聚组氨酸标签和S-Tag（TRAIL-His）;另一种是不加任何的外源标签蛋白（TRAIL-NH）,并初步比较了两种TRAIL蛋白的功能。RT-PCR法从人外周血单个核细胞中扩增TRAIL胞外段基因,克隆入pGEM-T-Easy载体, DNA序列测定鉴定正确性。然后分别将其克隆入原核表达载体pET-30a（His）/pET-28a（NH）。采用E.coli BL21（DE3）表达, Ni亲和柱和离子柱分离纯化目的蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定原核表达产物。MTT法、PI染色法及瑞氏-姬姆萨染色法观察TRAIL-His,TRAIL-NH蛋白的生物学活性。所表达目的蛋白分子量与预期蛋白分子量相一致,该蛋白可以与抗TRAIL多克隆抗体及抗组氨酸标签抗体反应,并可抑制人淋巴瘤细胞系Jurkat细胞的增殖和诱导Jurkat细胞凋亡。另一方面对本室获得的一株抗DR5单抗mDRA6进行人源化改造以扩大其应用前景。采用分子生物学的方法首先对抗体进行嵌合化改造。首先用RT-PCR法从分泌mDRA6的杂交瘤中钓取可变区基因,克隆入pGEM-T-Easy载体,经测序后,在BLAST上进行比对证实为新的鼠源抗体。然后分别构建嵌合抗体c-mDRA6的轻重链真核表达载体VHexpress、VKexpress,酶切鉴定正确后,脂质体法转染宿主细胞293T,经72小时培养后,检测上清表达量, c-mDRA6表达量为490ng/ml.成功的实现了真核表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 TRAIL胞外段基因的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂与酶
• 1.1.2 主要试剂及溶液的配制
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 载体，细菌菌株与细胞株
• 1.1.5 引物设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA 的提取
• 1.2.2 RT-PCR 扩增TRAIL 基因
• 1.2.3 回收目的DNA
• 1.2.4 连接反应
• 1.2.5 转化
• 1.2.6 挑取及鉴定克隆
• 1.2.7 质粒提取及酶切鉴定
• 1.2.8 原核表达载体的构建
• 1.2.9 融合蛋白的诱导表达
• 1.2.10 Western Blot
• 1.2.11 sTRAIL 蛋白的纯化
• 1.2.12 MTT 法检测融合蛋白活性
• 1.2.13 细胞凋亡检测
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR 扩增 TRAIL 胞外段基因
• 2.2 靶基因序列测定及原核表达载体的构建
• 2.3 融合蛋白的诱导表达
• 2.4 Western blot
• 2.5 融合蛋白的纯化
• 2.6 MTT 法检测融合蛋白活性
• 2.7 sTRAIL 诱导细胞凋亡
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 抗DR5单克隆抗体mDRA6的人源化改造
• 1 抗DR5单克隆抗体mDRA6的功能鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 mDRA6 与Jurkat 细胞的结合情况
• 1.2.2 mDRA6 与 TRAIL 竞争结合实验
• 1.2.3 mDRA6 对 Jurkat 细胞生长抑制作用
• 1.2.4 mDRA6诱导Jurkat细胞凋亡
• 小结
• 2 嵌合抗 DR5 单克隆抗体的构建与表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• H和V_L基因的克隆及序列分析'>2.2.1 mDRA6 V_H和V_L基因的克隆及序列分析
• 2.2.2 嵌合抗体真核表达载体的构建
• 2.2.3 嵌合抗体的表达量
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 英文缩写及中英文对照
• 致谢
• 附录