论文摘要
研究海马神经干细胞培养、增殖和分化及其发生机制对缺血性脑血管病的防治具有十分重要的意义。海马是目前认为与学习记忆等高级功能具有密切关系的重要结构,海马中含有未分化的神经前体细胞,这些细胞在特定条件下分化成新的神经元和胶质细胞补充至成年脑组织中,可能为中枢神经系统损伤与变性疾病的研究与治疗提供新的途径。如果能够明确神经干细胞分化和增殖的调控因子,则可以控制其向某一特殊类型的细胞分化的方向,从而大大丰富了神经移植供体的来源。本实验以离体培养的新生大鼠海马神经干细胞为研究对象,以体外模拟脑缺血再灌注损伤为实验条件,主要采用生化检测手段和免疫细胞化学技术,研究了体外模拟脑缺血再灌注损伤对培养海马神经干细胞活性、增殖和分化的影响以及三七总皂甙的作用。1新生大鼠海马神经干细胞的培养、鉴定及其三七总皂甙的作用选取新生大鼠海马细胞,通过原代细胞培养、传代和免疫荧光方法及MTT法离体研究三七总皂甙对大鼠海马神经干细胞增殖的影响。结果显示,细胞有Nestin表达,本研究中分离的细胞具备了神经干细胞的基本属性,属于中枢神经系统的干细胞。应用MTT法测定不同浓度、同一时间点三七总皂甙对神经干细胞增殖的影响和不同时间点、同一浓度三七总皂甙对神经干细胞增殖的影响。结果显示三七总皂甙在4.375～560μg/ml剂量时,对神经干细胞的增殖有促进作用,在17.5μg/ml时的作用最强;当药物浓度在1120～4480μg/ml时,给药组和对照组没有显著差异,可能是因为药物对神经干细胞增殖的促进作用和抑制作用达到了一个平衡。在17.5μg/ml浓度时,给予三七总皂甙24h后给药组与对照组OD值有明显差异,说明给予三七总皂甙24h后才能起到促进神经干细胞增殖的作用。2新生大鼠海马神经干细胞缺血再灌注模型建立本实验应用氧糖剥夺（OGD）法对培养新生大鼠海马神经干细胞进行体外造膜,应用MTT法离体研究造膜对培养海马神经干细胞的影响。结果显示,细胞OGD处理后,不同时间点的细胞活性与正常对照组比较,最初活性升高,随后活性下降,4h、6h显著差异。1h处于活性增高阶段,2h处于增高持平期。4h开始低于对照组,与2h比较有明显统计学意义（P<0.05）。6h细胞活性已明显低于正常组,有极显著差异（P<0.01）,与4h比较有明显统计学意义。说明氧糖剥夺（OGD）法造成了细胞损伤,且细胞损伤呈现一定发展规律。3体外模拟脑缺血再灌注损伤对培养新生大鼠海马神经干细胞的影响及三七总皂甙的作用本实验采用免疫荧光双标方法和MTT法研究三七总皂甙对新生大鼠海马神经干细胞增殖、分化和自我更新的作用。结果显示,与对照组相比,模型组Nestin/Brdu、Nestin/Vimentin、Nestin/Tuj-1表达的阳性细胞面密度、光密度和细胞个数比对照组明显减少,统计具有显著性差异;与模型组相比,三七总皂甙组Nestin/Brdu、Nestin/Vimentin、Nestin/Tuj-1表达的阳性细胞面密度、光密度和细胞个数比对照组明显增多,统计具有显著性差异;MTT法也显示,与对照组相比,模型组细胞OD值明显下降,统计具有显著性差异;与模型组相比,给药组细胞OD值明显增大,统计具有显著性差异。提示三七总皂甙能够促进离体新生大鼠海马神经干细胞的存活和增殖,并且能够促进离体胚鼠皮层神经干细胞分化为新的神经元和胶质细胞,同时也表明三七总皂甙对损伤海马神经干细胞具有保护作用。4体外模拟脑缺血再灌注损伤对海马神经干细胞钙离子和膜电位的影响及三七总皂甙的作用本实验采用转液式多功能荧光发光检测仪法（NOVOstar）研究三七总皂甙对新生大鼠海马神经干细胞Ca2+和膜电位的影响及其Ca2+和膜电位与细胞增殖、分化的关系。结果显示,缺血处理4h后, NSCs胞内Ca2+浓度升高。三七总皂甙预处理可抑制NSCs内Ca2+浓度升高。缺血再灌注后NSCs胞内Ca2+浓度呈上升趋势,至再灌注2h胞内Ca2+浓度达到最高峰;再灌注3h胞浆内Ca2+浓度开始降低;在相同时间点药物预处理组胞内Ca2+浓度均在相同时间点药物预处理组胞内Ca2+浓度均低于缺血再灌注组,其中30min、1、2、3h时差异显著（P<0.05）;缺血处理4h后, NSCs膜电势下降,三七总皂甙预处理可抑制NSCs膜电势的下降。缺血再灌注后NSCs膜电势呈下降趋势,至再灌注2h膜电势下降至最低点,再灌注3h细胞膜电势开始上升;在相同时间点药物预处理组膜电势均高于缺血再灌注组,且在30min、1、2、3h差异显著;同时,发现对照组细胞内Ca2+浓度和膜电势变化都围绕在一定范围。说明,三七总皂甙对细胞的保护作用可能是通过抑制细胞外Ca2+内流和内源性Ca2+释放和通过改变细胞内外离子浓度从而改变细胞膜电势变化达到的;研究结果也表明,随着细胞增殖分化发展变化,细胞内Ca2+浓度和膜电势变化范围围绕在一定范围波动。综上所述,本研究成功分离培养海马神经干细胞并建立了体外海马神经干细胞缺血再灌注模型,在此基础上,揭示了中药三七总皂甙不仅对正常培养海马神经干细胞有促进增殖和分化作用,而且对体外模拟脑缺血再灌注使培养的海马神经干细胞有保护作用,并对其机理进行了探讨,为中医药防治脑血管疾病提供了良好的理论知识和重要的实验依据。
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标签：新生大鼠论文; 海马神经干细胞论文; 膜电位论文; 免疫荧光双标论文; 细胞培养论文; 钙离子论文; 脑缺血再灌注论文;