论文摘要
由链格孢属（Alternaria）真菌侵染引起的黑斑病是菊花广泛发生的重要叶部病害,在菊花栽培生产中,尤其是在温湿度较高的温室周年生产中、露地重茬连作条件下、脚芽夏插及夏季高温多雨季节时,植株或插穗发病较重,有时甚至可导致菊花整株叶片全部萎烂褐死。因此,培育抗黑斑病菊花新品种是菊花抗病育种的重要目标之一。然而,目前关于菊花黑斑病菌的研究还非常少,从部分菊花近缘种属植物中筛选黑斑病抗源和利用转基因技术提高菊花黑斑病抗性的研究尚未见报道。本研究以为利用菊花近缘种属植物进行栽培品种改良奠定前期工作基础和创造菊花黑斑病抗病新种质为目的,进行了菊花黑斑病菌分离鉴定、部分菊花近缘种属植物抗性鉴定评价、抗性相关叶片结构特征和防御酶活性、抗病相关基因hrfA转化菊花等研究。主要研究结果如下：1.菊花黑斑病菌的分离鉴定及人工接种利用组织分离法和柯赫氏法则鉴定从菊花发病叶片中分离到6个致病菌株,通过PCA培养基上和自然寄主叶片上形态特征观察发现：菌株A01、A03、A04和A07的分生孢子与A02、A09的相比,其孢身中部的隔膜明显较粗,呈黑褐色,主横隔膜处缢缩也更为显著；在自然寄主上,菌株A01、A02、A03、A04和A09的分生孢子一般单生或短链生（3～7个孢子）,A02和A09的孢子链有侧链分枝,菌株A07可形成罕分枝的超过10个孢子的分生孢子长链；产孢表型观察结果发现：菌株A01、A03、A04和A07可形成超过10个孢子的分生孢子长链,且多数长链不分枝,少数仅一次分枝且侧链较短（1～5个孢子）；菌株A02和A09的分生孢子链较短（少于10个分生孢子）,主链不明显,有多个侧链,分枝丰富,支链一般1～5个孢子。据上述形态特征鉴定A01、A03、A04和A07为细极链格孢（A.tenuisimma）,A02和A09为链格孢（A.alternata）.5.8S rDNA-ITS序列分析只能作为链格孢鉴定的辅助手段,可以将小孢子种与大孢子种区别开,而不能区分一些遗传差异较小的小孢子种。病菌离体接种试验结果表明6个菌株对菊花叶片的致病力没有差异；人工接种试验结果显示不同菌株孢子混合悬浮液接种确保发病的孢子液浓度最低为1×106/ml,不同菌株菌丝混合液接种浓度为1×107/ml时植株发病症状十分明显,是接种发病的合适浓度。2.部分菊花近缘种属植物苗期黑斑病抗性鉴定、抗性相关叶片特性及防御酶活性研究对33份菊花近缘种属植物苗期黑斑病抗性鉴定结果显示,供试的大部分材料都表现出不同程度的感病性,病情指数从33.60到91.66不等；紫菀属（Aster）的达摩菊（A.spathulifolius）和亚菊属（Ajania）的花矶菊（A,×marginatum）则表现为抗病,其病情指数分别为17.16和18.85；筑波矶菊（A.pacificum）、甘菊（D.lavandulifolium）、神农架野菊[D. Indicum （Shennongjia）]和云南蓍（A. wilsoniana）表现为中抗,病情指数从25.62到28.85不等。对苗期抗病材料达摩菊和花矶菊,高感材料尖裂野菊（D.indicum var.acutum）和贵州野菊[D. Indicum （Guizhou）]抗病相关形态结构特征分析发现,抗病材料叶片具有高而密的绒毛、高的蜡质含量和栅栏组织／海绵组织比例。抗病材料叶片正面绒毛密度为8.88 mm-2和17.84 mm-2,背面为11.36mm-2和37.98 mm-2,高度分别为1.01mm和0.13mm,而感病材料叶片正面绒毛密度为0.28mm-2和2.48 mm-2,背面为0.32 mm-2和4.92 mm-2,高度为0.08和0.078mm；抗病材料叶片蜡质含量分别为26.18和25.70,而感病材料仅为18.07和10.74。上述结果表明叶片表面绒毛的密度和高度、叶片蜡质含量及栅栏组织与海绵组织的比例与菊花近缘种属植物对黑斑病菌的抗性关系密切。对苗期抗黑斑病的达摩菊和花矶菊,高感黑斑病的尖裂野菊和贵州野菊叶片抗病相关防御酶活性研究结果显示,黑斑病菌接种前抗病材料叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶（CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）三种抗病相关防御酶的活性高于感病材料,接种后活性上升速度比感病材料快、幅度大且持续时间长。PAL和GLU活性在接种72h后达到峰值,而CHT活性在接种后96h达到峰值,接种后抗病材料三种酶的活性水平在不同接种时间点均显著高于感病材料。说明黑斑病菌接种前后菊花抗感近缘种属植物叶片的PAL、CHT及GLU活性与抗性密切相关,可作为其苗期黑斑病抗性评价的生理指标。3.农杆菌介导的hrfA基因转化菊花的研究对菊花品种‘碧玉台’、‘奥运火炬’‘意大利红’和‘神马’在添加6-BA和NAA激素组合的MS培养基上的再生频率进行统计分析,发现基因型差异是决定菊花再生能力的关键因子,品种‘碧玉台’具有高频再生能力,是基因遗传转化的良好受体系统,其叶片外植体再生合适的Km选择压力为15mg/L,生根选择压力为7.5mg/L；能够完全抑制农杆菌滋生并对外植体再生影响较小的Cb浓度为400mg/L；在此基础上,通过农杆菌介导的遗传转化获得了17株具Km抗性的hrfA基因转化株；PCR、Southern杂交及RT-PCR分子检测显示hrfA基因在其中7个株系的染色体上整合并成功表达；采用叶片离体接种和活体植株接种法对7个转基因菊花株系进行了黑斑病抗性测定,发现与非转基因植株相比,转基因株系的抗性明显提高；对转基因株系的表型特征观察发现,转基因株系的生长发育速度加快,开花期提前；三个转基因株系的结实率较野生型非转化株严重下降,其中两个株系的种子出苗率也明显下降,表明hrfA基因在菊花中的表达加快了植株的发育进程,但同时35S启动子的表达可能也给转基因株系带来了一些结实率下降、部分株系种子出苗率下降等的负面影响。对抗病能力较强的三个转基因株系3、7和10的T1代植株进行PCR及RT-PCR检测,结果显示导入的外源目的基因hrfA能够稳定地遗传到T1代植株中,并在转录水平上实现成功表达。