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茶多酚和β-淀粉样肽（25-25）对人红细胞的作用研究

2020-11-24阅读(116)

茶多酚和β-淀粉样肽（25-25）对人红细胞的作用研究

论文摘要

β淀粉样肽25-35(β-amyloid peptide 25-35，Aβ25-35)是Alzheimer’s disease（AD）神经元中β淀粉样肽39～43中的一段，其氨基酸序列为GSNKGAIIGLM。目前已知Aβ25-35可导致人红细胞溶血，但机制不清楚。有研究表明茶多酚对淀粉样肽1～40／42的神经毒性有抑制作用。为进一步了解Aβ25-35的细胞毒性作用，探究淀粉样肽的细胞毒性机制，本实验采用红细胞为材料，用Aβ25-35处理红细胞，分析血红蛋白和钾离子的释放，电泳分析红细胞膜蛋白图谱改变、红细胞谷胱甘肽（GSH）含量变化以及各种茶多酚对红细胞溶血的效应。实验结果表明，Aβ25-35对红细胞的溶血是一种非氧化和非渗透性损伤。在所测试的茶多酚化合物中，（-）表儿茶酚-3-五倍子酸（ECG）和（-）表没食子儿茶酚-3-五倍子酸（EGCG）对Aβ25-35诱导溶血具有明显不同的作用，其机制可能与EGCG和ECG对Aβ25-35聚集形态的影响有关。实验的主要方法和结论：一、Aβ25-35的溶血机制1．Aβ25-35与红细胞作用过程中血红蛋白和K+离子释放的时相分析在Aβ25-35与红细胞作用过程中，分别采用可见光分光光度计和原子吸收分光光度计对血红蛋白和K+离子的释放进行监测，血红蛋白和K+释放的时相没有差别，即血红蛋白和K+离子的释放是一种非渗透性释放，支持Aβ25-35对红细胞的损害是膜穿孔的假说。2．Aβ25-35对红细胞GSH含量的影响采用Ellman方法测定红细胞GSH含量。Aβ25-35可使红细胞内GSH含量降低，在低浓度范围内具有线性量效关系，当Aβ25-35浓度达到20μg／mL时作用达到饱和，GSH的最大耗损量为17％。说明由Aβ25-35导致的GSH含量的降低是很有限的。3．Aβ25-35对红细胞膜蛋白谱带的影响Aβ25-35处理红细胞后，提取细胞膜，用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带，未发现有明显变化，表明Aβ25-35对红细胞的损害没有导致膜蛋白的聚集。4．Aβ25-35对红细胞形态的影响红细胞与Aβ25-35孵育后，在显微镜下可观察到杯状细胞（Stomatocyte），以及大量的大小不一的球形囊泡。这些囊泡一部分可能源于棘突释放，另外部分可能来自于细胞膜碎片的再闭合和融合。二、茶多酚对红细胞溶血的效应本文对五种茶多酚EGCG，ECG，（-）表儿茶酚（EC），（-）表没食子酸（EGC）和（+）儿茶素（C）与红细胞的相互作用进行了研究，结果发现两种茶多酚EGCG和ECG对红细胞具有截然相反的作用，ECG可以促进Aβ25-35对红细胞的溶血作用，而EGCG则有强烈的抑制作用。1．EGCG和ECG还原能力的测定由于EGCG和ECG含有多酚结构，在生物体系中表现出强的抗氧化活性。EGCG和ECG对叔丁基氢过氧化物（t-BHP）诱导产生的脂质过氧化产物MDA具有相近的抑制作用，ECG的抑制作用略大于EGCG，说明EGCG和ECG对Aβ25-35诱导溶血作用的影响与它们的氧化还原能力无关。2．EGCG和ECG处理Aβ25-35之后的溶血效应经EGCG和ECG处理的红细胞对Aβ25-35的溶血作用表现出截然相反的结果。ECG可以促进Aβ25-35对红细胞的溶血作用，而EGCG则有强烈的抑制作用。将Aβ25-35和EGCG和ECG分别温浴处理，再与红细胞作用，其结果相同。EGCG和ECG对Aβ25-35溶血作用的差异可能与它们二者对Aβ25-35的聚集形态的影响相关。3．Aβ25-35经EGCG和ECG处理后的聚集形态淀粉样肽形成以β结构为主的纤维状聚集体，是其产生细胞毒性的主要环节。EGCG和ECG分别与Aβ25-35在37℃温育120min后，经透射电镜观察，对照呈纤维状，EGCG处理后聚集体呈无定形体，ECG处理后呈较小的无定形体，可能是纤维前体或者寡聚体。已有的研究报道证实，蛋白淀粉样变性过程中的纤维前体或者寡聚体具有强的细胞毒性作用，这与本文的结果是一致的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 文献综述
  • 1.1 淀粉样肽及其相关疾病简介
  • 1.1.1 淀粉样肽的发现和形成
  • 1.1.2 淀粉样肽相关疾病
  • 1.2 B淀粉样肽
  • 1.2.1 B淀粉样肽与阿尔兹海默疾病
  • 1.2.2 B淀粉样肽的来源及其毒性简介
  • 1.3 红细胞的结构和功能
  • 1.3.1 红细胞膜的组成
  • 1.3.2 红细胞的抗氧化体系
  • 1.4 自由基的产生和对红细胞的损伤
  • 1.5 茶多酚抗氧化的生物学效应
  • 1.6 茶多酚对淀粉样纤维的影响
  • 1.7 茶多酚与质膜的相互作用
  • 1.8 结束语
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料和试剂
  • 2.1.1 材料和药品
  • 2.1.2 溶液及配制
  • 2.2 实验仪器
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 红细胞的分离
  • 25-35导致的红细胞溶血和钾离子释放测定'>2.3.2 AB25-35导致的红细胞溶血和钾离子释放测定
  • 25-35处理后红细胞的表面形态观察'>2.3.3 AB25-35处理后红细胞的表面形态观察
  • 25-35处理对红细胞GSH含量的影响'>2.3.4 AB25-35处理对红细胞GSH含量的影响
  • 2.3.5 红细胞膜的制备
  • 2.3.6 SDS-PAGE分离膜蛋白
  • 2.3.7 茶多酚对红细胞的氧化保护处理及丙二醛（MDA）的测定
  • 2.3.8 高浓度茶多酚对红细胞溶血的时间效应
  • 2.3.9 茶多酚对红细胞的溶血的影响
  • 25-35影响的透射电镜观察'>2.3.10 茶多酚对AB25-35影响的透射电镜观察
  • 2.4 统计学处理
  • 3 结果
  • 25-35对红细胞的溶血'>3.1 AB25-35对红细胞的溶血
  • 25-35导致的红细胞溶血和钾离子释放'>3.2 AB25-35导致的红细胞溶血和钾离子释放
  • 25-35对-40℃冰箱存放20天和60天红细胞溶血的影响'>3.3 AB25-35对-40℃冰箱存放20天和60天红细胞溶血的影响
  • 25-35处理后红细胞的表面形态观察'>3.4 AB25-35处理后红细胞的表面形态观察
  • 3.5 GSH含量测定
  • 3.5.1 乙腈对GSH显色的影响
  • 3.5.2 GSH含量标准曲线
  • 3.5.3 回收率
  • 3.5.4 稳定性
  • 25-35处理红细胞的GSH含量测定'>3.5.5 AB25-35处理红细胞的GSH含量测定
  • 3.6 SDS-PAGE膜蛋白图谱
  • 3.7 茶多酚对红细胞的氧化保护处理及MDA的测定
  • 3.7.1 EGCG、E、EC对t-BHP产生的MDA的影响
  • 3.7.2 EGCG和ECG对t-BHP诱导的MDA产生的影响
  • 3.8 高浓度茶多酚对红细胞溶血的时间效应
  • 3.8.1 EGCG、ECG和EGC对红细胞溶血的影响
  • 3.8.2 E和EC对红细胞溶血的影响
  • 25-35导致的红细胞溶血的影响'>3.9 茶多酚对AB25-35导致的红细胞溶血的影响
  • 25-35诱导的红细胞溶血的影响'>3.9.1 EGCG、EGC、ECG对AB25-35诱导的红细胞溶血的影响
  • 25-35导致的血红蛋白和K+释放的影响'>3.9.2 五种茶多酚对AB25-35导致的血红蛋白和K+释放的影响
  • 25-35导致的血红蛋白和钾离子释放的比较'>3.9.3 不同处理的AB25-35导致的血红蛋白和钾离子释放的比较
  • 25-35影响的透射电镜观察'>3.10 茶多酚对AB25-35影响的透射电镜观察
  • 4 讨论
  • 4.1 乙腈沉淀蛋白的谷胱甘肽测定方法的建立
  • 25-35导致的红细胞溶血的研究'>4.2 AB25-35导致的红细胞溶血的研究
  • 25-35导致的红细胞溶血的影响'>4.3 茶多酚对AB25-35导致的红细胞溶血的影响
  • 4.3.1 茶多酚对红细胞的作用
  • 4.3.2 茶多酚对淀粉样肽的作用
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间的研究成果

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