弓形虫SAG5B和SAG1基因的克隆表达及其对小鼠免疫保护性研究

论文摘要

目的:克隆刚地弓形虫RH株表膜的sag1以及一种新发现的基因sag5b,并构建原核表达载体pET28a/sag1和pET28a/sag5b ,表达弓形虫表膜蛋白SAG1和SAG5B。利用此重组蛋白免疫小鼠,观察对小鼠的抗弓形虫感染的能力。同时对照比较RH株弓形虫基因组与Praugniud株弓形虫基因组中sag5b基因,用于虫株毒力鉴别的可能性。方法:复苏本室液氮保种的RH株弓形虫速殖子,腹腔接种Balb/c小鼠,转种3代,抽取腹水,收集、纯化弓形虫速殖子,并用蛋白酶K裂解法提取基因组DNA,同时制备速殖子粗抗原并免疫新西兰白兔,收集兔抗弓形虫多抗血清。剖杀脑组织中含有Praugniud株弓形虫包囊的小鼠,获取含有包囊的脑组织。引物设计时分别在引物两端引入EcoRI和XhoI以及EcoRI和HindIII酶切位点。PCR扩增出弓形虫sag5b以及sag1基因片断,目的基因sag5b以及sag1基因片断插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,双酶切鉴定并获得目的基因,插入原核表达载体pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,并用Lowry法测定纯化rSAG5B及rSAG1蛋白浓度。将两种纯化的蛋白以及弓形虫粗抗原分别皮下免疫Balb/c小鼠,再进行攻击感染,以观察小鼠的存活情况。以佐剂为空白对照。结果:利用PCR从RH株弓形虫基因组中克隆出1104bp的sag5b目的基因片段。成功地将其克隆入pET28a。sag5b-pET28a经EcoRI和XhoI双酶切,获得与目的基因大小相一致的基因片段,测序结果与GenBank比对sag5b同源性100%。含sag5b-pET28a的宿主菌E.coliBL21（DE3）经IPTG诱导后高效表达rSAG5B蛋白。分别以RH株弓形虫基因组以及含有Praugniud株弓形虫包囊的脑组织为模板,PCR法扩增sag5b,只有在RH株基因组中发现该基因。此外,利用PCR从RH株弓形虫基因组中克隆出1101bp的sag1目的基因片段。将其克隆入pET28a载体。sag1-pET28a经EcoRI和HindIII双酶切,获得与目的基因大小相一致的基因片段,测序结果与GenBank比对sag1同源性100%。含sag1-pET28a的宿主菌E.coliBL21（DE3）经IPTG诱导后高效表达rSAG1。上述两种重组蛋白经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rSAG5B和rSAG1蛋白。SDS-PAGE检测其分子量:rSAG5B为43KDa, rSAG1为30KDa,二者分别与各自的预期分子量大小相符。Western blotting显示:rSAG5B与rSAG1蛋白都能够被抗弓形虫的多抗血清中的相应抗体识别,获得了两种纯化的具有特异免疫反应的重组蛋白。将这两个纯化的重组蛋白以及制备的弓形虫粗抗原分别与福氏佐剂乳化后皮下免疫Balb/c小鼠,同时以福氏佐剂为空白对照。每只小鼠的抗原用量为20μg,两周后加强一次,佐剂改为福氏不完全佐剂。末次免疫后一个月,用RH株弓形虫速殖子腹腔注射小鼠进行攻击感染,统计学比较发现rSAG5B和rSAG1与粗抗原对小鼠的免疫保护作用没有显著性差异（P>0.05）,而均比空白对照组（未免疫组）生存时间长,有显著性差异（P<0.05）。结论:成功地从弓形虫RH株基因组中获取了sag5b基因以及sag1,构建了sag5b-pET28a/sag1-pET28a重组质粒,并获得了高效表达;对比RH株基因组与Praugniud株基因组表明,sag5b可能作为鉴别强毒株与弱毒株的遗传标志。制备RH株弓形虫速殖子粗抗原并免疫新西兰白兔获得抗弓形虫多抗血清。粗抗原与获得的纯化重组蛋白分别免疫Balb/c小鼠,并与空白做比较发现,rSAG5B以及rSAG1均对小鼠有免疫保护作用,且与粗抗原的作用相仿。对弓形虫新发现的表膜蛋白SAG5B对小鼠的免疫保护性的研究,有助于开发有效的预防弓形虫感染的疫苗。

论文目录

• 中英文词对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 3.1 DNA 的纯度和含量
• 3.2 PCR 获得目的基因
• 3.3 阳性克隆载体 pMD18-T/sag5b 和 pGEM-T/sag1 的筛选及鉴定
• 3.4 弓形虫重组基因 pET28a-sag5b 及 pET28a-sag1 的亚克隆及鉴定
• 3.5 弓形虫重组质粒 pET28a-sag5b 的基因序列测定及分析
• 3.6 弓形虫 sag5b,sag1 基因表达产物的 SDS-PAGE 分析
• 3.7 重组质粒 pET28a/sag5b,pET28a/p30 诱导表达产物 Western blotting 鉴 定
• 3.8 重组蛋白 SAG5B 和 SAG1 对小鼠的免疫保护性研究
• 3.9 比较 RH 株弓形虫基因组与 Praugniud 株基因组的 sag5b 基因
• 讨论
• 4.1 弓形虫 SAG1 超家族的生物学特性
• 4.2 弓形虫 SAG5B,SAG1 基因的克隆、表达、鉴定以及免疫保护性研究
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二（个人简历）
• 附录三（致谢）
• 附录四（综述）
• 参考文献