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肝肠首过效应对齐墩果酸生物利用度的影响研究

2020-12-11阅读(889)

肝肠首过效应对齐墩果酸生物利用度的影响研究

论文摘要

研究目的：齐墩果酸（Oleanolic acid）,3β-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid,是五环三萜类化合物,临床上用于治疗肝炎,肝纤维化,肝硬化,但其生物利用度低影响其临床应用,国内外未见肝肠首过效应对其生物利用度影响的研究报道。本文研究目的为采用高效液相色谱-质谱联用技术（LC/MS/MS）,分析肝肠首过效应对齐墩果酸生物利用度的影响,有助于为临床用药及开发新剂型提供理论依据。研究方法：1生物样品中齐墩果酸的LC/MS/MS检测方法的建立生物样品的预处理采用乙酸乙酯液-液萃取齐墩果酸,甘草次酸作为内标物；色谱柱：Gemini110AC18column （50mm×2.0mm i.d.,5μm）,流动相A为0.01%甲酸水,B为乙腈,采用梯度洗脱,流速：0.3mL/min。采用质谱的电喷雾离子源（ESI）的负离子模式,多通道离子监测（MRM）：齐墩果酸（m/z455.3→455.3,[M-H]-）；内标甘草次酸（m/z469.4→425.3,[M-H]-）。对专属性、灵敏度、线性范围、回收率、精密度、基质效应、稳定性等方法学进行考察。2齐墩果酸多途径给药的体内药物动力学研究齐墩果酸在体内的研究内容主要包括：①在人工胃液中齐墩果酸的稳定性。②体外齐墩果酸的血浆-红细胞分布动力学。③齐墩果酸与人血清白蛋白的结合率。④灌胃以及尾静脉给药大鼠齐墩果酸的组织分布。⑤灌胃大鼠齐墩果酸胃肠道残留量以及尿粪便排泄量。⑥静脉、灌胃、十二指肠、门静脉四种给药途径给大鼠齐墩果酸的药物动力学。3齐墩果酸在体外肝肠微粒体的代谢反应研究齐墩果酸的体外微粒体孵育反应主要包括：①齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的NADPH依赖性代谢以及UDPGA依赖性代谢。②齐墩果酸在大鼠肠微粒体中NADPH依赖性代谢以及UDPGA依赖性代谢。③齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的化学抑制剂试验。4酮康唑和茶碱对齐墩果酸在大鼠体内的药代动力学影响将大鼠分为对照组、酮康唑（CYP3A抑制剂）组和茶碱（CYP1A2底物）组,对照组给予0.5%CMC-Na,酮康唑组给予酮康唑（20mg/kg）,茶碱组给予茶碱（50mg/kg）,各组于30min后灌胃齐墩果酸（50mg/kg）,于设定的时间点取血浆测定齐墩果酸的浓度,得到三个组别齐墩果酸的药动曲线以及相关的药动学参数。结果：1本文所建立的齐墩果酸血药浓度LC/MS/MS测定方法具有简便、准确、稳定、重现性好、灵敏度高的优点。该分析方法符合生物样品测定要求,可应用于相关药代动力学研究。2齐墩果酸在体内的研究结果表明在人工胃液中齐墩果酸比较稳定；体外齐墩果酸的血浆-红细胞分布能快速达到分布平衡,满足药动学血浆样品处理要求,血浆-红细胞分布率为2.35±0.42；齐墩果酸与人血清白蛋白的结合约8小时达到平衡,在浓度50-200ng/mL范围内结合率为77.11%±2.80%-83.21%±1.57%,可见齐墩果酸的血清白蛋白结合率较高,由此推断齐墩果酸在人体内的半衰期较长；灌胃以及尾静脉给药大鼠齐墩果酸的组织分布有时间差异性,灌胃主要分布在胃肠道,静脉给药则主要分布在脾肺肾组织；灌胃大鼠齐墩果酸胃肠道残留量以及尿粪便排泄量之和约为2.19%±0.77%；多途径给药的药动学显示其生物利用度为0.77%,肝摄取率为35.18%,肠摄取率为98.73%,肝首过效应0.70%,胃首过效应0.088%,肠首过效应95.82%,因此齐墩果酸的首过消除主要发生在肠道而不是肝脏和胃部。3齐墩果酸的体外微粒体孵育反应结果显示齐墩果酸在大鼠肝微粒体中存在NADPH依赖性的氧化反应以及UDPGA依赖性Ⅱ相结合反应的,其中Ⅰ相反应速率为128.5±36.2nmol/min/mg protein,Ⅱ相反应速率为115.8±18.3nmol/min/mg protein,且根据Eadie-Hofstee plots可知参与氧化反应的酶不是单一酶；齐墩果酸在大鼠肠微粒体中也存在NADPH依赖性代谢以及UDPGA依赖性代谢,代谢反应速率分别是42.4±10.9,90.4±12.9nmol/min/mg protein,参与氧化反应的酶也不是单一的酶；化学抑制剂试验表明CYP3A抑制剂酮康唑与CYP1A2抑制剂α-奈黄酮显著抑制了齐墩果酸的NADPH依赖性的氧化代谢,因此,推测CYP3A,CYP1A2是参与齐墩果酸代谢的主要酶。4酮康唑和茶碱对齐墩果酸在大鼠体内的药代动力学影响实验结果表明与对照组比较,酮康唑组和茶碱组给药后灌胃齐墩果酸,齐墩果酸的药动学参数发生改变,提高了AUC和Cmax。给予酮康唑和茶碱后齐墩果酸的AUC增加,齐墩果酸的药动学改变可归因于酮康唑对代谢齐墩果酸的代谢酶CYP3A的抑制以及茶碱对代谢酶CYP1A2的利用,即CYP3A和CYP1A2参与齐墩果酸的代谢。结论：本论文建立了符合生物样品测定要求的LC/MS/MS分析方法,可应用于相关药代动力学研究。齐墩果酸肝肠首过效应是其低生物利用度的重要原因,肠首过效应占主要原因。齐墩果酸在大鼠的肝微粒体以及肠微粒体中都存在NADPH依赖性的氧化反应以及UDPGA依赖性Ⅱ相结合反应,且参与氧化反应的酶为非单一性酶,结合体外酶化学抑制剂孵育与体内酶抑制剂实验初步确定齐墩果酸的代谢酶包括CYP3A,CYP1A2。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 引言
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 肝肠首过效应与生物利用度的研究现状
  • 1.1.1 首过效应
  • 1.1.2 代谢酶系
  • 1.1.3 药物动力学模型法在首过效应研究中的应用
  • 1.2 齐墩果酸的研究进展
  • 1.2.1 齐墩果酸的药理研究进展
  • 1.2.2 齐墩果酸的代谢研究
  • 第2章 生物样品中齐墩果酸的LC/MS/MS检测方法的建立
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 药品与试剂
  • 2.1.2 动物
  • 2.1.3 仪器与设备
  • 2.2 方法学考证
  • 2.2.1 色谱条件
  • 2.2.2 质谱条件
  • 2.2.3 对照品溶液的配制
  • 2.2.4 生物样品的处理
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 方法学的专属性
  • 2.3.2 标准曲线的制备以及定量下限测定
  • 2.3.3 精密度与准确度
  • 2.3.4 提取回收率
  • 2.3.5 基质效应
  • 2.3.6 稳定性
  • 2.4 对论
  • 第3章 齐墩果酸多途径给药的体内药物动力学研究
  • 3.1 试验材料
  • 3.1.1 药品与试剂
  • 3.1.2 动物
  • 3.1.3 仪器与设备
  • 3.1.4 色谱与质谱条件
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 人工胃液中齐墩果酸的稳定性
  • 3.2.2 体外齐墩果酸的血浆-红细胞分布率研究
  • 3.2.3 体外齐墩果酸与人血清白蛋白的结合率
  • 3.2.4 大鼠灌胃以及尾静脉给药的组织分布
  • 3.2.5 灌胃给药大鼠胃、肠、粪便、尿液齐墩果酸的残留量
  • 3.2.6 大鼠静脉注射、灌胃、门静脉给药、十二指肠给药四种给药途径的齐墩果酸药动学研究
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 人工胃液中齐墩果酸的稳定性
  • 3.3.2 体外齐墩果酸的血浆-红细胞分布率研究结果
  • 3.3.3 平衡透析实验结果
  • 3.3.4 大鼠灌胃以及尾静脉给药的组织分布
  • 3.3.5 灌胃给药大鼠齐墩果酸胃肠残留量以及粪便尿液排泄量
  • 3.3.6 门静脉给药齐墩果酸的肝首过效应
  • 3.3.7 口服给药齐墩果酸的胃肠首过效应以及肝首过效应
  • 3.4 讨论
  • 第4章 齐墩果酸体外肝肠微粒体的代谢反应研究
  • 4.1 试验材料
  • 4.1.1 药品与试剂
  • 4.1.2 动物
  • 4.1.3 仪器与设备
  • 4.1.4 色谱与质谱条件
  • 4.2 试验方法
  • 4.2.1 溶液的配制
  • 4.2.2 大鼠肝肠微粒体的制备
  • 4.2.3 齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的代谢
  • 4.2.4 齐墩果酸在大鼠肠微粒体中的代谢
  • 4.2.5 齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的化学抑制剂试验
  • 4.2.6 样品处理与样品分析
  • 4.2.7 标准曲线的制备
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的NADPH依赖性Ⅰ相、UDPGA依赖性Ⅱ相反应以及酶动力学实验
  • 4.3.2 齐墩果酸在大鼠肝微粒体中的酶动力学实验
  • 4.3.3 齐墩果酸在大鼠肠微粒体中的NADPH依赖性Ⅰ相、UDPGA依赖性Ⅱ相反应
  • 4.3.4 齐墩果酸在大鼠肠微粒体中的酶动力学实验
  • 4.3.5 齐墩果酸在肝微粒体中的化学抑制剂试验
  • 4.4 讨论
  • 第5章 酮康唑和茶碱对齐墩果酸的药动学行为的影响
  • 5.1 试验材料
  • 5.1.1 药品与试剂
  • 5.1.2 动物
  • 5.1.3 仪器与设备
  • 5.1.4 色谱与质谱条件
  • 5.2 试验方法
  • 5.2.1 给药方案与血样采集
  • 5.2.2 样品分析与数据处理
  • 5.3 结果
  • 5.4 讨论
  • 结语与展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读硕士学位期间发表的论文情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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