异羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的设计、合成与生物活性研究

论文摘要

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是目前发现的最重要的抗癌靶点之一,广泛存在于真核细胞中,目前,已发现的这种酶有18个亚型,按其与酵母组蛋白去乙酰化酶的同源性可分为两大类：一类为Zn2+依赖性的组蛋白去乙酰化酶（包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类HDAC）,一类为NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶（Ⅲ类HDAC）。HDAC抑制剂能阻断组蛋白的赖氨酸侧链氨基去乙酰化,从而改变DNA的结构,起到调控基因的表达的作用,并能增强DAN基因组的稳定性,使正常基因突变发生的几率减小,同时提高HDAC乙酰化还能使细胞分裂周期阻滞,诱导细胞分化和凋亡,抑制肿瘤血管生成等作用。HDAC抑制剂的结构主要有苯胺类,异羟肟酸类,亲电酮类等结构,HDAC抑制剂Vorinostat和Romidepsin已分别于2006年和2009年被美国FDA批准上市用于治疗皮肤T淋巴细胞瘤（CTCL）,还有更多的化合物作为HDAC抑制剂进入临床研究,这些都预示了这类新型的抗肿瘤药物具有广阔的应用前景。异羟肟酸结构的HDAC抑制剂可能引起血液异常,味觉紊乱,疲劳腹泻,同时由于异羟肟酸基团的稳定性差,使这类药物的应用受到限制,苯胺类HDAC抑制剂通常比对应的异羟肟酸类活性低。我们选用HDAC-2（3MAX）酶,通过计算机辅助药物设计,设计合成了18个N-羟基-N-苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺类结构化合物,在异羟肟酸基的氮原子上连接苯环或取代苯环,使苯环或取代苯环与锌离子底部14A疏水空腔作用,使整个设计分子更好的与酶的催化活性中心结合,同时降低异羟肟酸结构的酸性,达到降低副作用的目的。合成以取代硝基苯,4-硝基苯甲酸,4-氯苯甲酰氯、苯甲酰氯和苯乙酰氯为原料,4-硝基苯甲酸经过酯化,还原,苯甲酰化,水解,酰化制得4-苯甲酰胺基苯甲酰氯,取代硝基苯在雷尼镍催化下,还原成N-羟基取代苯胺,与4-苯甲酰胺基苯甲酰氯反应合成4-苯甲酰胺基-N-羟基-N-苯基苯甲酰氨及其类似物,并用HRMS、13CNMR和1HNMR确证其结构。通过酶抑制实验,目标化合物对HeLa细胞提取酶半数抑制浓度在微摩尔级,羟胺苯环上邻位取代时如化合物a2,b2,c2活性较低,邻位氯取代活性高于邻位甲基取代活性,化合物对位取代时活性最高,如化合物a4,a6,c4,c6有较好的抑制活性（IC50<10 u M）,且活性优于阳性对照药SAHA（IC60=10.8μM）。采用MTT法测定化合物对人宫颈癌细胞（Hela）、人非小细胞肺癌细胞（A-549）、人食管癌细胞株（EC-109）、人肝癌细胞株（Hep G2）和人前皮肤成纤维细胞株（HFF）增值的抑制作用,根据测定结果进行了生物活性与构效关系的初步研究,筛选出化合物al,b1,b4,c4,c6对肿瘤细胞作用强于SAHA或相当,对正常纤维细胞的作用低于SAHA,进一步进行了小鼠体内毒性试验和小鼠体内抗肿瘤实验。体内急毒实验中al,b1,b4,c4,c6的小鼠半数致死IC50>3.3mmol/kg,高于SAHA IC50=2.92mmol/kg,说明筛选化合物的毒性远小于SAHA。体内抗肿瘤实验中化合物b4,c6的半数有效量为197.4μmol/kg和136.4μmol/kg均小于对照药SAHA的值294.6μmol/kg,化合物c6的抑制活性优于b4,是SAHA的两倍。本文揭示了N-羟基-N-苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺类结构化合物抗肿瘤作用的确切性和安全性优势,并对抗肿瘤的机理进行了研究,但其进一步作用机制、亚急性毒性、代谢动力学和其它药学等有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂的研究进展
• 1.1 引言
• 1.2 组蛋白去乙酰化酶概述
• 1.2.1 染色质与组蛋白
• 1.2.2 组蛋白的乙酰化与去乙酰化
• 1.2.3 组蛋白去乙酰化酶的分类
• 1.2.4 组蛋白去乙酰化酶的结构与功能
• 1.2.5 组蛋白去乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤机制
• 1.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂研究概述
• 1.3.1 短链脂肪酸类HDAC抑制剂
• 1.3.2 苯胺类HDAC抑制剂
• 1.3.3 异羟肟酸类HDAC抑制剂
• 1.3.4 亲电酮类HDAC抑制剂
• 1.3.5 环肽类HDAC抑制剂
• 1.3.6 硫醇类HDAC抑制剂
• 1.3.7 其它结构HDAC抑制剂
• 1.4 总结
• 1.5 选题目的依据
• 第二章 HDAC抑制剂的结构与合成路线设计
• 2.1 引言
• 2.2 HDAC抑制剂的设计
• 2.2.1 目标化合物的结构设计
• 2.2.2 计算机辅助药物设计
• 2.3 目标化合物的合成路线设计
• 2.3.1 异羟肟酸的合成方法
• 2.3.2 酰氯的合成方法
• 2.3.3 目标化合物的合成路线
• 第三章 目标化合物的合成及表征
• 3.1 实验仪器及试剂
• 3.1.1 实验仪器及试剂
• 3.1.2 试剂的处理
• 3.2 化合物的合成实验操作
• 3.2.1 N-取代苯基羟胺的合成通法
• 3.2.2 4-氨基苯甲酸甲酯的合成
• 3.2.3 目标化合物a1-6和b1-6的合成通法
• 3.2.4 目标化合物c1-6的合成通法
• 3.3 中间化合物的图谱数据
• 3.4 目标化合物的图谱数据
• 第四章 体外药理活性筛选与作用机制研究
• 4.1 组蛋白去乙酰化酶抑制实验
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验材料
• 4.2 实验原理
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 实验组的设置与化合物的配制
• 4.3.2 实验步骤
• 4.4 酶抑制实验结果及讨论
• 4.5 体外细胞实验仪器及材料
• 4.5.1 实验仪器
• 4.5.2 实验材料
• 4.5.3 实验用溶液的配制
• 4.6 MTT法测定目标化合物的体外活性
• 4.6.1 MTT法的实验原理
• 4.6.2 预实验
• 4.6.3 目标化合物的细胞活性测定
• 4.7 体外活性评价结果与讨论
• 4.7.1 数据处理结果
• 4.7.2 结果讨论
• 第五章 苗头化合物的体内抗肿瘤作用研究
• 5.1 体内活性实验材料
• 50)的测定'>5.2 半数致死量(LD₅₀)的测定
• 5.2.1 预实验
• 5.2.2 正式实验
• 5.2.3 实验结果与讨论
• 5.3 化合物b4,c6体内抗肿瘤活性评价
• 5.3.1 药理模型的建立
• 5.3.2 化合物剂量的选择
• 5.3.3 化合物溶液的配制
• 5.3.4 小鼠的编号称重和给药体积的计算
• 5.3.5 小鼠的给药和处理
• 5.4 数据处理与结果讨论
• 5.4.1 数据的处理
• 5.4.2 建模成功性分析
• 5.4.3 化合物抗肿瘤活性
• 第六章 结论
• 6.1 主要结论
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 附图
• 1. N-羟基-N-苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺（a1）
• 2. N-羟基-N-o-甲基苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺（a2）
• 3. N-羟基-N-m-甲基苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺（a3）
• 4. N-羟基-N-p-甲基苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺（a4）
• 5. N-羟基-N-o-氯苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺（a5）
• 6. N-羟基-N-p-氯苯基-4-苯甲酰胺基-苯甲酰胺（a6）
• 7. N-羟基-N-苯基-4-（4-氯苯甲酰胺基）-苯甲酰胺（b1）
• 8. N-羟基-N-o-甲基苯基-4-（4-氯苯甲酰胺基）-苯甲酰胺（b2）
• 9. N-羟基-N-m-甲基苯基-4-（4-氯苯甲酰胺基）-苯甲酰胺（b3）
• 10. N-羟基-N-p-甲基苯基-4-（4-氯苯甲酰胺基）-苯甲酰胺（b4）
• 11. N-羟基-N-o-氯苯基-4-（4-氯苯甲酰胺基）-苯甲酰胺（b5）
• 12. N-羟基-N-p-氯苯基-4-（4-氯苯甲酰胺基）-苯甲酰胺（b6）
• 13. N-羟基-N-苯基-4-（4-苯乙酰胺基）-苯甲酰胺（c1）
• 14. N-羟基-N-o-甲基苯基-4-（4-苯乙酰胺基）-苯甲酰胺（c2）
• 15. N-羟基-N-m-甲基苯基-4-（4-苯乙酰胺基）-苯甲酰胺（c3）
• 16. N-羟基-N-p-甲基苯基-4-（4-苯乙酰胺基）-苯甲酰胺（c4）
• 17. N-羟基-N-o-氯苯基-4-（4-苯乙酰胺基）-苯甲酰胺（c5）
• 18. N-羟基-N-p-氯苯基-4-（4-苯乙酰胺基）-苯甲酰胺（c6）
• 在学期间的研究成果
• 致谢