海南捕鸟蛛毒素与电压门控钠通道作用机制研究

海南捕鸟蛛毒素与电压门控钠通道作用机制研究

论文摘要

蜘蛛毒液中的多肽毒素有亲和力强,专一性高的特点。它们能被用于药理学研究,还能够作为很好的工具试剂来研究电压门控钠通道结构与功能的关系。虽然已经报道过一些狼蛛毒液中存在电压门控钠通道抑制剂,但是很少有人研究它们与VGSCs相互作用的机制。海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ(HNTX-Ⅲ)是一种从海南捕鸟蛛毒液中分离得到的33个残基的多肽。在本课题中,我们研究了 HNTX-Ⅲ结构和功能的关系。HNTX-Ⅲ是一个河豚毒素敏感型电压门控钠通道的选择性拮抗剂,能够作用于DRG上TTX-S型钠通道,但是对TTX-R型钠通道没有作用。在本实验检测的六种钠通道亚型中,HNTX-Ⅲ能抑制Nav1.1,Nav1.2,Nav1.3 和 Nav1.7,其中对 Nav1.7 尤为敏感,但是对Nav1.4和Nav1.5没有作用。我们通过在HEK293细胞上表达Nav1.7电流来检测HNTX-Ⅲ对它的抑制作用。HNTX-Ⅲ抑制Nav1.7的电流,但是对电流-电压的关系曲线、激活和失活动力学、失活恢复动力学都没有明显的改变。HNTX-Ⅲ对Nav1.7的抑制并不迅速,时程为20.5±0.3秒,在1 μ M的浓度下HNTX-Ⅲ与Nav1.7的结合可以被洗脱。HNTX-III 对 Nav1.1,Nav1.2,Nav1.3 和 Nav1.7 的抑制效果表现出浓度依赖性,半数有效抑制浓度值(IC50)分别约为1.27 μM,275 nM,491 nM和232 nM。短的超强去极化刺激能够部分激活结合了毒素的钠通道,这表明HNTX-III对通道的抑制具有电压依赖性。在一个超强的去极化刺激后,HNTX-III能够增强Nav1.7的去激活。HNTX-Ⅲ-Nav1.7复合物在长时程强去极化条件下逐步被电压依赖性解离,之后未结合毒素的Nav1.7需要经过长时间的复极化才能重新与毒素结合。此外,通道嵌合体实验表明DIIS3-S4的胞外连接环是HNTX-Ⅲ结合Nav1.7的关键位置。这些数据表明,HNTX-Ⅲ与Nav1.7作用于位点4,在通道静息状态下捕获电压敏感元件。我们之前已经通过二维核磁共振解析出了 HNTX-Ⅲ的结构,HNTX-Ⅲ属于抑制剂胱氨酸结(ICK)模体。结构分析表明,疏水和芳香族氨基酸残基主要位于毒素的C-末端,某种程度上可能构成HNTX-Ⅲ结合Nav1.7相关的两亲性表面。通过点突变实验,我们发现E818是决定Nav1.7对HNTX-Ⅲ敏感性的关键残基,突变体E818Q能够使HNTX-Ⅲ相较野生型Nav1.7的亲和力下降超过50倍。本实验的数据表明,HNTX-Ⅲ抑制Nav1.7的激活,是通过一种类似的虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ的新机制,即在关闭状态下结合Nav1.7的位点4,从内向捕获DII的电压敏感元件。我们的研究结果表明,HNTX-Ⅲ与Nav1.7作用的机制、结合的特异性、亲和力与β-蝎毒素以及其他β—蜘蛛毒素不同。目前的研究结果有助于我们进一步了解毒素-钠通道相互作用的机制,同时也提供了一种研究钠通道亚型结构和功能关系的有用工具,并且可能作为镇痛相关药物开发的模板。海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ),由35个氨基酸残基组成,含6个半胱氨酸,以Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ的方式配对形成3对二硫键。在检测的五个VGSCs亚型中,能够选择性的抑制Nav1.2,Nav1.3和Nav1.7,对Nav1.4和Nav1.5没有影响,其中对hNav1.7是最敏感的,半有效抑制浓度(IC50)约为21nM。对比许多其他作用于VGSCs的狼蛛毒素,HNTX-Ⅳ在亚饱和浓度下并没有改变电流-电压(Ⅳ)曲线,也没有改变激活和失活的动力学。定点突变实验表明毒素结合于hNav1.7 DII S3-S4胞外连接环(位点4)。突变体E753Q,D816N和E818Q对hNav1.7的亲和力分别降低2.0,3.3和130倍。这个区域的其它残基突变对毒素的抑制活性影响很小。HNTX-IV与Nav1.7相互作用的分子模型实验表明,HNTX-IV和Nav1.7DII之间接口处紧密接触的残基形成一种三趾爪结构,这个结构能稳定毒素-通道复合物,阻碍DII电压敏感元件的运动,抑制Nav1.7的激活。与β-蝎毒素在向外位置捕获DIIS4电压敏感元件不同,我们认为HNTX-IV在通道的关闭状态在向内捕获DII的电压敏感元件。我们的实验数据不仅提供了药物设计的结构模型,而且也为特异性VGSCs拮抗剂的筛选提供了潜在的结构模板。本实验室已经从海南捕鸟蛛中发现了几种作用于TTX-S型钠通道的毒素,但是目前还没有发现能够抑制TTX-R型的组分,因此我们首先在粗毒水平检测了对大鼠DRG细胞上TTX-R型钠通道的影响,发现海南捕鸟蛛粗毒中确实存在TTX-R型钠通道的抑制剂。通过在ND7-23细胞上表达Nav1.8筛选经反相HPLC分离后粗毒中的各个组分,发现了 4种能够抑制Nav1.8的组分,分子量分别为3977,3605.6,3537.5,3828.6Da,根据质谱鉴定的结果和反相HPLC的洗脱浓度,我们推测分子量为3828.6Da毒素就是实验室之前报道过的HNTX-VII,氨基酸序列为 ECRYWLGTCSKTGDCCSHLSCSPKHGWCVWDWT,四个组分中3977对Nav1.8的抑制作用最强,我们对该组分进行了富集,用Edman降解法测出氨基酸序列为 QCRYWLGTCSKTGDCCSQLSCSPKQHWCVWDWW。Nav1.8和疼痛关系密切,是临床治疗神经病理性疼痛的靶点,但是目前还没有研究Nav1.8很好的工具试剂,筛选专一性好的分子对于Nav1.8的研究有重要意义。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 电压门控钠离子通道及其毒素研究进展
  • 1.1 前言
  • 1.2 钠离子通道
  • 1.2.1 电压门控钠通道
  • 1.2.2 电压门控钠通道的研究进展
  • 1.2.3 钠通道相关疾病
  • 1.3 电压门控钠通道毒素
  • 1.3.1 毒素位点分析
  • 1.3.2 神经毒素结合位点1
  • 1.3.3 神经毒素结合位点2
  • 1.3.4 神经毒素结合位点3
  • 1.3.5 神经毒素结合位点4
  • 1.3.6 神经毒素结合位点5
  • 1.3.7 神经毒素结合位点6
  • 1.4 本课题的研究背景和意义
  • 第二章 海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ(HNTX-Ⅲ)与钠通道相互作用的分子机制研究
  • 2.1 前言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 粗毒和动物
  • 2.2.2 试剂和仪器
  • 2.2.3 HNTX-Ⅲ的分离纯化
  • 2.2.4 钠通道Nav1.7突变体和嵌合体的构建
  • 2.2.5 HEK293细胞异源表达电压门控钠通道
  • 2.2.6 膜片钳活性分析
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 HNTX-Ⅱ的分离和纯化
  • 2.3.2 HNTX-Ⅲ对大鼠DRG细胞上电压门控钠通道的影响
  • 2.3.3 HNTX-Ⅲ对表达在HEK293细胞VGSC亚型的抑制效应
  • 2.3.4 HNTX-Ⅲ电压依赖性的抑制在HEK293细胞中表达的Nav1.7
  • 2.3.5 HNTX-Ⅲ结合在Nav1.7 DII的S3-S4胞外连接环
  • 2.3.6 HNTX-Ⅲ对Nav1.7去激活动力学的影响
  • 2.3.7 HNTX-Ⅲ与Nav1.7突变体的相互作用
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 HNTX-Ⅲ是一种神经元TTX-S VGSCs的选择性的拮抗剂
  • 2.4.2 HNTX-Ⅲ通过在关闭状态下结合位点4捕获电压敏感元件来抑制Nav1.7的开放
  • 2.4.3 HNTX-Ⅲ有别于作用于VGSCs的其他β-毒素
  • 2.4.4 HNTX-Ⅲ的结构与功能关系
  • 第三章 海南捕鸟蛛毒素HNTX-Ⅳ与电压门控钠通道相互作用的分子机制研究
  • 3.1 前言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 粗毒和动物
  • 3.2.2 试剂和仪器
  • 3.2.3 HNTX-Ⅳ的分离纯化
  • 3.2.4 钠通道质粒和构建Nav1.4,Nav1.5和Nav1.7的突变体
  • 3.2.5 HEK293细胞异源表达VGSCs
  • 3.2.6 膜片钳活性检测
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 HNTX-Ⅳ毒素的分离纯化
  • 3.3.2 HNTX-Ⅳ对VGSC亚型的选择性
  • 3.3.3 亚饱和浓度下HNTX-Ⅳ对Nav1.2,1.3,1.7激活和失活的影响
  • 3.3.4 电压门控钠通道DIIS3-S4的氨基酸残基决定着通道对HNTX-Ⅳ的敏感性
  • 3.3.5 Three-toed claw模型用于稳定HNTX-Ⅳ-Nav1.7复合物
  • 3.4 讨论
  • 第四章 海南捕鸟蛛粗毒中筛选Nav1.8抑制剂
  • 4.1 背景
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 粗毒和动物
  • 4.2.2 试剂和仪器
  • 4.2.3 大鼠DRG细胞
  • 4.2.4 海南捕鸟蛛粗毒的分离纯化
  • 4.2.5 MALDI-TOF质谱分子量鉴定
  • 4.2.6 嵌合体的构建
  • 4.2.7 ND7-23细胞异源表达Nav1.8通道
  • 4.2.8 电生理活性分析
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 海南捕鸟蛛粗毒对大鼠DRG细胞上TTX-R钠通道的影响
  • 4.3.2 海南粗毒中筛选表达于ND7-23细胞Nav1.8通道的抑制剂
  • 4.3.3 HN3977的VGSC亚型筛选
  • 4.4 讨论
  • 第五章 主要研究结论与进一步研究设想
  • 参考文献
  • 附录 缩写表(中英文对照)
  • 论文发表情况
  • 致谢
  • 相关论文文献

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