rAAV9载体介导PGC-1α基因靶向治疗心肌缺血的体外研究

论文摘要

目的：构建含有肌球蛋白重链增强子（myosin heavy chain enhance,MHC）的心肌特异性启动子人脑钠肽启动子（Human brain natriuretic peptide promoter, hBNP）和过氧化物酶体增生激活受体γ辅激活因子1α（Peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α, PGC-1α）基因的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）载体的包装质粒pA AV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α,并包装9型和6型重组腺相关病毒,转导细胞,观察其在有氧和缺氧的环境下心肌细胞的基因表达。方法：1、pAAV-MHC-hBNP-Myc -PGC-1α质粒构建以pAAV-MHC-hBNP-LacZnls为模板PCR扩增获得α-MHCenh-hBNPpro启动子（简称MHC-hBNP）。用MHC-hBNP替代现有pAAV-CMV-PGC-1α质粒中巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）启动子,获得pAAV-MHC-hBNP-PGC-1α。然后将PGC-1α引入Myc标签抗体,即得到p AAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α。2、rAAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α病毒构建将pAAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α,及现有质粒pHelper, pAAV9或pAAV6质粒,用三质粒共转染的方法转染293细胞,并对病毒进行纯化及病毒检测。用Dot Blot检测病毒滴度,用十二烷基磺酸纳-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）检测病毒纯度。3、MHC-hBNP启动子,PGC-1αα基因表达活性及rAAV6-MHC-BNP-Myc-PGC-1α病毒包装功能的验证MHC-hBNP启动子,PGC-1αα基因的表达活性通过pAAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α进行验证,通过将质粒转染293细胞,48小时后行Myc tag染色及4,6-联脒-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI）染色。将rAAV6-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α包装的病毒转导293细胞,48小时后行Myc tag染色及DAPI染色。同时转导原代心肌细胞,分别置于正常有氧和缺氧的环境下培养,转导48h后收集细胞提取蛋白后行VVestern Blot检测Myc的表达。结果：1、成功构建了pAAV2.1-MHC-hBNP-PGC-1α, pAAV2.1-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α包装质粒。2、pAAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α能在293细胞表达。3、成功的包装了rAAV9-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α、rAAV9-MHC-hBNP-PGC-1α和rAAV6-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α三种病毒,病毒滴度不低于10’2个／ml。4、rAAV6-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α病毒转导原代心肌细胞能表达,且缺氧环境下表达明显升高。结论：成功构建了含有α-MHC-hBNP启动子和PGC-1α基因的重组腺相关病毒载体的包装质粒（pAAV-MHC-hBNP-PGC-1α和pAAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α）,并包装rAAV9-MHC-hBNP-PGC-1α、rAAV9-MHC -hBNP-Myc-PGC一1α和rAAV6-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α三种病毒,rAAV6在体外转导293细胞,PGC-1α基因能正常表达,同时,rAAV6在体外转导原代心肌细胞,在缺氧的环境下表达量明显增高,为进一步rAAV9体内基因治疗心肌缺血打下坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 pAAV-MHC-hBNP-PGC-1α的构建
• 3.2 pAAV-MHC-hBNP-Myc-PGC-1α的构建
• 3.3 pAAV-MHC-BNP-Luc构建
• 3.4 a-MHC-BNP启动子功能验证
• 3.5 rAAV病毒的包装及检测
• 3.6 α-MHC-hBNP启动子可诱导表达功能验证及重组病毒介导PGC-1α在心肌细胞中表达
• 3.7 原代心肌细胞分离培养及缺氧模型的建立
• 3.8 不同血清型rAAV病毒转导原代心肌细胞
• 3.9 rAAV6病毒缺氧功能验证
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 英文缩写词表
• 攻读硕士学位期间的主要成果
• 致谢