HBx缺失突变体转化人肝细胞的机制及HBx蛋白促人肝星状细胞增殖与上调TGF-β1和CTGF的研究

论文摘要

第一部分HBx缺失突变体转化人肝细胞的机制目的:慢性乙型肝炎病毒感染和HBx基因整合与肝细胞癌（HCC）的发生密切相关。整合的HBx基因通常发生缺失或点突变。一些研究已表明HBx突变体具有完全不同于野生型HBx的生物学功能,它可能在HBV相关性HCC发生中发挥重要作用。我们的前期研究也已显示,与野生型HBx比较,HBx缺失突变体能明显促进肝细胞的增殖和恶性转化。但其具体的分子机制仍未阐明,基于蛋白质组学方法在研究癌变机制方面的优势,本课题拟应用蛋白质组学技术从蛋白质整体水平了解HBx缺失突变体致癌机制。而MicroRNA（miRNA）是一类在转录或翻译水平调控基因表达的小RNA分子,参与发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。miRNA表达出现异常,可能导致人类疾病的发生包括肿瘤。因此本课题又通过microRNA芯片技术分析转染HBx缺失突变体和野生型HBx基因的肝细胞之间的miRNA的差异表达,为进一步研究miRNA在HBV相关HCC发病机制中的作用打下基础。方法:（1）前期实验我们已建立稳定表达HBx缺失突变体和野生型HBx蛋白的人肝细胞株（即QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx-2215细胞株）。本课题中运用RT-PCR和Western blot再次验证这两组细胞中HBx mRNA和蛋白表达。（2）采用蛋白质组学技术分析QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx -2215细胞之间差异蛋白表达:首先利用固相pH梯度（Immobilized pH gradient,IPG）双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）分离这两组细胞的总蛋白质,考马斯亮蓝染显色,建立双向凝胶电泳图谱,再用PDQuest软件分析2-DE图像,选取部分差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）分析获取肽质量指纹图谱,Mascot软件搜索SwissProt数据库鉴定差异蛋白质。（3）采用microRNA芯片技术分析QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx-2215细胞间的miRNA的差异表达:首先用Trizol法从这两组细胞分离总RNA,核酸蛋白仪测定RNA浓度和纯度,变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量。再用Hy3TM标记miRNA,然后与miRNA芯片杂交,GenePix 4000B激光共聚焦扫描仪扫描杂交芯片,将图像信息转换成数字型数据,最后应用GenePix Pro4.0软件分析原绐数据筛选出差异表达的miRNA。结果:（1）RT-PCR和Western blot显示QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx- 2215细胞中HBx mRNA和蛋白高表达。（2）获得了分辨率和重复性好的QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx-2215细胞的双向凝胶电泳图谱,两组细胞各3块凝胶的平均蛋白质点数分别为920±24和950±27,平均匹配率分别为87.2%和89.1%。筛选出差异表达蛋白点55个,其中在QSG7701-HBx-d382细胞中32个上调,23个下调。选取其中15个差异点进行质谱分析,从中获得12张较好的肽质量指纹,经查询蛋白质序列数据库鉴定出了12个蛋白质,其中一些与细胞增殖、凋亡、信号转导有关。（3）从QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx-2215两组细胞分离的RNA质量好,适合下步的miRNA芯片杂交。miRNA芯片杂交结果显示miR-7a、miR-15a、miR-122、miR-17、miR-585、miR-886-5p、miR-886-3p、miR-494、miR-668在QSG7701-HBx-382细胞中下调,miR-443、miR-663、miR-429在QSG7701-HBx-382细胞中上调,差异表达均在2倍以上。结论:（1）本研究建立了分辨率高且重复性好的QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx-2215细胞的双向凝胶电泳图谱,并鉴定出部分差异表达蛋白质,为阐明HBx缺失突变体致癌机制奠定了初步基础。（2）miR -7a、miR-15a、miR-122、miR-17、miR-585、miR-886-5p、miR-494、miR-668、miR-443、miR-663、miR-429在QSG7701-HBx-d382和QSG7701-HBx-2215两组细胞中差异表达。这些结果提示上述miRNA可能与缺失突变HBx诱导肝细胞恶性转化有关,也可能在HBV相关的HCC发生发展中起着重要作用。第二部分HBx蛋白促人肝星状细胞增殖和上调TGF-β1和CTGF的研究目的:慢性乙型肝炎是导致肝纤维化的主要原因,而且许多慢性乙型肝炎最终都经过肝纤维过程进展为肝硬化、肝癌,然而乙型肝炎病毒（HBV）诱导肝纤维化的机制尚未完全阐明。目前普遍认为,HBV感染肝细胞后引起肝脏炎症坏死,释放多种致纤维化因子,激活邻近的肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）,使其大量增殖并产生大量细胞外基质（ECM）,从而形成肝纤维化。本课题拟研究HBV编码的一多功能蛋白HBx蛋白能否与肝星状细胞细胞作用促进其增殖与上调纤维化的细胞因子的表达,有利于纤维化的形成。方法:首先建立表达HBx蛋白的肝细胞（QSG7701-HBx）与LX-2细胞（人肝星状细胞株）共培养系统。共培养后用氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法与流式细胞术检测HBx蛋白对LX-2细胞增殖的影响;应用RT-PCR检测共培养后LX-2细胞a-SMA、TGF-β1、CTGF和ColⅠ（Ⅰ型胶原）的mRNA表达;应用Western blot检测共培养后LX-2细胞a-SMA、TGF-β1和CTGF蛋白表达;同时应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测共培养后细胞上清液中Ⅰ型胶原浓度。结果:（1）采用3H-TdR掺入法测定HBx蛋白对LX-2细胞增殖作用,结果显示,与QSG7701-HBx共培养的LX-2细胞摄取3H-TdR的量（31252±2210cpm）明显高于与两对照组QSG7701-pcDNA3和QSG7701细胞共培养的LX-2细胞摄取量（14055±1021cpm,13500±942cpm,P＜0.05）,表明HBx蛋白能促进LX-2细胞的增殖。（2）流式细胞技术分析细胞周期显示,与QSG7701-HBx组共培养的LX-2细胞的G1期细胞减少,反映细胞增殖指数（PI）的S+G2期细胞明显增加（P＜0.05）。与QSG7701、QSG7701-pcDNA3和QSG7701-HBx细胞共培养的LX-2细胞的S+G2期所占的百分比分别为25.2±2.0%、24.5±1.6%和39.6±2.0%。（3）RT-PCR结果显示,HBx蛋白可明显提高LX-2细胞α-SMA、TGF-β1、CTGF和ColⅠ的mRNA表达（P＜0.05）。（4）Western blot分析显示,HBx蛋白可明显上调LX-2细胞α-SMA、TGF-β1和CTGF蛋白表达（P＜0.05）。（5）ELISA检测LX-2细胞分别与QSG7701、QSG7701-pcDNA3和QSG7701-HBx细胞共培养的上清液colⅠ,其浓度分别为191.2±20.8 ng/ml、200.2±21.6ng/ml和500.5±43.4ng/ml,QSG7701-HBx组明显高于两对照组（P＜0.05）,这表明HBx蛋白能促进LX-2细胞分泌ColⅠ,有助于肝纤维化的形成。结论:本实验应用表达HBx蛋白的肝细胞与HSC共培养研究发现HBx蛋白能促进HSC的增殖,上调其TGF-β1和CTGF的表达,促进其合成和分泌Ⅰ型胶原。这可能是慢性乙肝感染者形成肝纤维化的一条新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词简表
• 第一部分 HBx缺失突变体转化人肝细胞的机制
• 前言
• 第一章 HBx缺失突变体转染QSG7701细胞的蛋白质组研究
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 第二章 HBx缺失突变体和野生型HBx基因转染的QSG7701细胞microRNA差异表达
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 讨论
• 第二部分 HBx蛋白促人肝星状细胞增殖和上调TGF-β1和CTGF的研究
• 1.前言
• 2.实验材料
• 3.实验方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果