大肠杆菌海藻糖磷酸合成酶otsA基因、大麦HVA1基因的克隆及对小麦的遗传转化

论文摘要

小麦是世界上最重要的粮食作物之一,其产量和品质对保障世界粮食的供给等方面占有重要地位,而全球范围内的干旱,大面积的土地盐渍化,以及其它多种非生物胁迫严重影响着小麦的正常产量,因此培育能够抵抗多种非生物胁迫的优良小麦品种具有十分重要的意义。利用基因工程手段改良农作物抗逆性状,具有不受种属限制、引入基因明确、效果明显、周期较短等优点。本研究克隆了两个与植物抵抗非生物胁迫相关的基因:大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因（otsA）、大麦胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA蛋白）基因HVA1,并通过农杆菌介导的苗端转化法将其导入小麦,期望提高小麦对非生物胁迫的抵抗能力,获得有育种价值的小麦种质资源。 海藻糖是两个葡萄糖分子通过1,1糖苷键结合而成的非还原性双糖。在生物体内扮演着极其重要的角色,它具有保护细胞膜、酶和蛋白质结构的特殊功能,使生物具有较强的抗旱、耐寒能力;最近的研究表明在生物体内海藻糖代谢对糖信号感知、碳代谢及光合作用具有调节作用。 大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶是其合成海藻糖的关键酶,催化UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸产生海藻糖-6-磷酸,编码该酶的基因为otsA。本研究通过PCR方法分离到该基因,并分别构建了由组成型启动子Ubiqitin和干旱诱导启动子RD29A驱动的两个植物表达载体pRAL-otsA、pR29A-otsA,为了更容易通过生物安全性检测,所构建的这两个表达载体均不含有选择标记基因。通过农杆菌介导的苗端转化法将pRAL-otsA导入小麦烟2801,获得214棵T0代植株,对其中140株进行了PCR检测,发现9棵阳性植株;对种植的69个株系276棵T1代植株进行PCR检测获得了21棵阳性植株,而且在T1代植株中出现了大量的表型变异,这为研究海藻糖基因在小麦育种中的作用提供了材料。 胚胎晚期发育丰富蛋白（LEA蛋白）是在种子发育过程中的胚胎发育晚期

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 文献综述
• 1. 植物抵抗非生物胁迫的信号传导途径及分子机理
• 2. 海藻糖及其代谢的功能及在遗传改良中的应用
• 第二部分 研究工作
• 一、材料与方法
• 1. 试剂与材料
• 2. 常规方法
• 3. E．coli海藻糖磷酸合成酶基因otsA的克隆及表达载体构建
• 4. 大麦LEA蛋白基因HVA1的克隆及表达载体构建
• 5. otsA、HVA1基因对小麦遗传转化及转基因植株检测
• 二、结果与分析
• 1. E． coli otsA基因克隆及其表达载体构建
• 1.1 PCR扩增otsA基因
• 1.2 目的片段与T载体连接及重组子鉴定
• 1.3 测序结果
• 1.4 pRAL-otsA表达载体构建
• 1.5 通用植物表达载体pR29A构建
• 1.6 pR29A-otsA表达载体构建
• 2. HVA1基因克隆及表达载体构建
• 2.1 大麦叶片总RNA提取
• 2.2 RT-PCR结果
• 2.3 目的片段与T载体连接及重组子鉴定
• 2.4 测序结果
• 2.5 pRAL-HVA1表达载体构建
• 2.6 pR29A-HVA1表达载体构建
• 3. 小麦的苗端转化
• 0代植株表型'>3.1 otsA、HVA1基因转化小麦及T₀代植株表型
• 0、T₁代PCR检测'>3.2 转pRAL-otsA小麦植株的T₀、T₁代PCR检测
• 1代植株表型'>3.3 转pRAL-otsA T₁代植株表型
• 三、讨论
• 1. 关于小麦的苗端转化
• 1代植株的变异'>2. 关于转pRAL-otsA T₁代植株的变异
• 3. 关于提高载体构建过程中连接效率的措施
• 工作总结及展望
• 参考文献（REFERENCES）
• 致谢
• 发表文献
• 学位论文评阅及答辩情况表